即用型 PCR 试剂盒 3.0 是在本公司即用型 PCR 试剂盒 2.0 的基础上改良而来，内含 Taq DNA 聚合酶、dNTPs、MgCl₂、反应缓冲液、PCR 增强剂、上样染料（对 A 型）等所有PCR 所需要的成分, 具有广泛的用途。 本产品具有下列特点：,

1. 方便，用户只需准备模板和引物即可以进行PCR 实验。

2. 产品为 2×预配液，操作步骤已经最大限度地简化，能减少污染，降低实验误差。

3. 扩增效率和灵敏度更高。

4. 本产品 A 型含电泳染料,PCR 反应液可直接上样电泳，进一步简化了操作。

5. 产物可直接用于 T 载体克隆，不需要额外的加 A 反应。

6. 本产品足够 50 次 40 mL 体系的常规 PCR。

7. 本产品只供科研使用。PCR 反应的影响因素

变性温度与时间：模板变性温度是决定PCR 反应中双链 DNA 解链的温度，达不到变性温度就不会产生单链 DNA 模板，PCR 也就不会启动。变性温度低则变性不完全， DNA 双链会很快复性，因而减少产量。变性温度太高，又会影响酶的活性。一般情况下可设为 94℃ 20~30 秒，高温时间应尽量缩短，以保持耐热 DNA 聚合酶的活力， 最高变性温度不宜超过 95℃。

退火温度与时间：退火温度决定 PCR 特异性与产量。温度高特异性强，但过高则引物不能与模板牢固结合，DNA 扩增效率下降；温度低产量高，但过低可造成引物与模板

错配，非特异性产物增加。合适的退火温度一般在 45~68℃之间。设置特定反应的最适退火温度，可根据引物的（G+C）%含量进行推测，一般实验中退火温度比扩增引  物的熔解温度 Tm 低 5℃，退火时间一般为 30~60 秒，足以使引物与模板之间完全结合，长时间退火没有必要。

延伸温度与时间：PCR 反应的延伸温度一般选择在 70~75℃之间，延伸时间根据所用

聚合酶扩增速度和扩增片段大小设定，如同样扩增 2 Kb 片段，若使用 Taq 酶只需 1 分钟，使用 Pfu 酶则应设定 2 分钟以上。延伸时间过长会导致非特异性扩增带的出现，时间太短则可能得不到扩增产物或得到一些短的非特异性片段。

循环次数：可根据模板 DNA 的量、扩增片段的大小和扩增产物的下步应用等因素，设

定 20-40 个循环。循环次数太少，扩增量不足，如果循环次数太多，错配几率会增加， 非特异性背景严重。所以，在保证产物得率的前提下，应尽量减少循环次数。

酶量：50 μL 反应体系可用 0.5-5 U 酶，酶量的选择与模板DNA 的量，扩增片段大

小等有关，酶量过多易发生非特异性反应，而且可能增加突变的机率，尤其在进行高

保真扩增时，应尽量减少酶量，但酶量过少时反应性能下降