Tet诱导表达载体构建技术服务

目前，已经研究开发出了多种Tet调控表达载体系统，主要分为Tet-on系统和Tet-off系统。在进行基因功能研究中，多用Tet-on系统，而Tet-off系统基本弃用。

百恩维生物能为您提供Tet-on诱导表达系统的载体构建服务，并且有多种表达载体供您选择：

1. 常规的真核表达的两质粒Tet-on系统（见图1）。

2. 百恩维生物自主开发的病毒（慢病毒、腺病毒、腺相关病毒）单质粒Tet-on系统（见图2），构建好的质粒可直接用于真核表达，也可包装相应的病毒后使用，感染效率更高，目标基因诱导表达水平更强。

3. 病毒单质粒Tet-on系统不仅可以表达目标基因，也可用于表达ShRNA。

4. 百恩维生物自主开发的病毒单质粒Tet-on系统，含有GFP标记基因、药筛标记（Neomycin、Puromycin），可用于构建稳转细胞株。

★ Tet诱导表达原理

四环素（Tet）诱导调控表达系统的基本原理是由诱导药物（如Tet）改变调控蛋白质的构象，从而控制目标蛋白质的表达。最初的Tet诱导调控基因表达系统是以大肠杆菌Tn10转座子上Tet抗性操纵子为基础而建立的。Tet阻遏蛋白(Tet repressor protein, TetR)与Tet操纵基因(Tet operator, TetO)DNA序列有特异的亲和能力，当细胞内无Tet存在时，TetR会与TetO结合，从而阻断下游的抗性基因表达。当有Tet存在时，药物使TetR的构象发生改变，导致TetR与TetO分离，从而引起抗性基因的抑制解除，抗性蛋白表达使细菌产生耐药性。

利用TetR和TetO特异结合的特性，目前开发改造了多种类型的Tet调控表达载体系统，但根据其表达特点可以归为两大类：抑制型系统Tet-off和激活型系统Tet-on。

★ Tet-off调控系统

最早的Tet-off基因调控表达系统由调节表达载体和反应表达载体组成。调节表达载体包含一个由人巨细胞病毒早期启动子(PhCMV)启动Tet转录活化因子(tetracycline transcrip-tional activator, tTA)，tTA由TetR与单纯疱疹病毒(HSV)VP16蛋白质C端的一段转录激活区融合而成。反应表达载体由Tet应答元件(Tet-responsive element, TRE)、最小CMV启动子(minimal CMV promoter, Pmin

CMV)及目的基因组成。目的基因位于TRE和PminCMV的下游；TRE为7次重复的TetO序列。PminCMV缺失增强子，因此在tTA未结合到TRE时，目的基因不表达；相反，当tTA结合到TRE时，VP16会使PminCMV活化从而使基因表达。当细胞内无Tet或其衍生物强力霉素(doxcycline, Dox)的存在时，tTA可与TRE结合，打开基因表达；而当Tet或Dox存在时，它们可使tTA中的TetR改变构象，则tTA将从TRE上脱落下来，使TRE中的PminCMV处于非激活状态，从而使基因表达处于关闭状态。（详见图3）

★ Tet-on调控系统

Tet-on调控系统与Tet-off调控系统的区别在于其调节蛋白质为反义Tet转录活化因子(reverse tetracy-cline transcriptional activator, rtTA)。rtTA是由反义TetR(reverse TetR, rTetR)与VP16的转录活化区域融合而成。rTetR由TetR中的4个氨基酸发生突变而衍生而来的。rTetR的表型与TetR相反，在无Dox时，其不能结合TRE，导致基因表达关闭；而在有Dox存在时，其会结合在TRE上，导致基因表达开放。（详见图4）

★ Tet诱导调控表达系统的优点

1. 具有低本底与高诱导倍数的特点，无诱导时目的基因表达水平低，诱导时其表达水平增高，最高诱导倍数可达10,000倍。

2. 诱导所需的时间短，Dox为脂溶性，容易渗透细胞和组织，在加入诱导剂30分钟内即可检测到目的基因的表达。

3. 该诱导系统是一种可逆系统，当去除诱导剂一定时间后可使该系统关闭，之后仍可通过加入诱导剂重新开启。

4. 诱导药物为Tet或其衍生物(如Dox)，安全。Tet作为一种抗生素已被人们应用了很长时间，已被广泛作为抗生素使用，是对人体较为安全的一种药物。

★ Tet诱导调控表达系统的应用

Tet系统被广泛应用于动物体内和体外（细胞水平）基因功能、蛋白质功能、以及mRNA功能的研究，也用于体外基因治疗的研究。

比如该系统已成功的用于胰岛细胞、肺组织、脑组织以及帕金森病、软骨病等基因治疗实验研究中，目前该系统也用于诱导多能干细胞(induced luripotent stem cell, iPS cell)技术中的重编程因子表达的调控。

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