细胞增殖服务

       四甲基偶氮唑盐比色法（MTT方法）是通过快速简便的颜色反应来检测细胞存活数量。

       原理：MTT可作为哺乳类动物细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶的底物。当有活细胞存在时，线粒体内琥珀酸脱氢酶可将淡黄色的MTT还原成蓝紫色的针状甲瓒 （Formazan）结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在570nm波长处测定其吸光度OD值，OD值的高低 可间接反映活细胞的数量及其活性。

        优点：经济、灵敏度高，可用于大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

        缺点：由于MTT经还原所产生的formazan结晶产物不溶于水，需有机溶剂溶解后才能检测，这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且有机溶剂对实验人员也有损害。

     技术服务内容

        1、细胞培养与接种；

        2、处理（如药物处理等）；

        3、MTT检测及数据分析；

        4、技术服务报告提交。

     客户提供：

        详细的MTT实验设计，如药物处理浓度、处理时间等。

     实验服务报告内容：

        1、MTT实验原始数据及分析结果，如曲线图、IC50等；

        2、MTT技术服务所需试剂耗材、仪器设备、实验方法各一份。

细胞凋亡检测服务

      细胞凋亡（apoptosis）一般是指机体细胞在发育过程中或在某些因素作用下，发生的一种程序性细胞死亡(programmed cell death)。细胞凋亡不是一件被动的过程，而是主动过程，它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，它并不是病理条件下，自体损伤的一种现象，而 是为更好地适应生存环境而主动争取的一种死亡过程。
        根据细胞凋亡的形态学和生物化学变化，一般常用的检测方法包括：形态学检测，Annexin V 法，线粒体膜势能的检测，DNA 片断化检测，TUNEL 法，Caspase-3 活性的检测，TFAR19 蛋白的表达和细胞定位分析。
        

Tunel法检测细胞凋亡

       TUNEL细胞凋亡检测 (TUNEL Apoptosis Assay) 是一种高灵敏度又快速简便的细胞凋亡检测方法。对于待检测的细胞或组织样品，经过生物素标记和后续的DAB显色等步骤，即可在普通光学显微镜下观察到凋亡 细胞。细胞在发生凋亡时，会激活一些DNA内切酶，这些内切酶会切断核小体间的基因组DNA。细胞凋亡时抽提DNA进行电泳检测，可以发现 180-200bp的DNA ladder。

        基因组DNA断裂时，暴露的3'-OH可以在末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)的催化下加上生物素(Biotin)标记的dUTP(Biotin- dUTP)，随后和辣根过氧化物酶(HRP)标记的Streptavidin (Streptavidin-HRP)结合，最后在HRP的催化下通过DAB显色来显示凋亡细胞，从而可以通过普通光学显微镜检测到凋亡的细胞。
 
服务内容
       1.     组织切片/细胞爬片

        2.     常规TUNEL检测
        3.     荧光TUNEL试剂盒检测
        4.     数据整理及结果分析
        *根据客户需要对细胞核进行荧光染色

客户须知：
       1.     由客户提供荧光TUNEL检测试剂盒

        2.    本公司保证数据的客观性、准确性，但不保证与客户预期吻合

提供结果：
       1.     成像图片（或按客户需要排列图片，达到可直接发表水平）

        2.     实验详细流程
        3.     原始数据
        4.     标记后（处理后）的样本

样本要求：
       1.     悬浮生长培养细胞的甩片或涂片

        2.     贴壁生长的培养细胞 
        3.     冰冻切片 
        4.     常规石蜡切片
 

Annexin V-FITC/PI流式法检测细胞凋亡

        在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸只分布在细胞膜脂质双层的内侧，细胞发生凋亡最早期，膜磷脂酰丝氨酸（PS）由脂膜内侧翻向外侧，这一变化早于细胞皱缩、染色 质浓缩、DNA片断化和细胞膜的通透性增加等凋亡现象。Annexin V是一种磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料，它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将 Annexin V与PI匹配使用，就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。

细胞迁移与侵袭

实验介绍
      将 Transwell 小室放入培养板中，小室内称上室，培养板内称下室，上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔，将研究的细胞种在上室内，由于聚碳酸酯膜有通透性，下层培养液中的成分 可以影响到上室内的细胞，应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜，就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。
 
      实验步骤：

      1材料准备：
      可 拍照显微镜，Transwell小室，孔径8μm，没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用)，Transwell迁移实验的细胞培养板 24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套，BD公司的Matrigel，无血清DMEM，(1%胎牛血清)DMEM和1640培养 基，DMEM完全培养基，1640完全培养基（也可加到20%血清），无菌PBS，棉签，胰酶，4%多聚甲醛固定液或者甲醇，结晶紫染液（0.1% （g/ml）PBS结晶紫）
 
      2步骤和流程
      2.1基质胶铺板：
       用BD公司的Matrigel 1：8（根据细胞产生mmp的量来决定）稀释，包被Transwell小室底部膜的上室面，置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。
 
      2.2制备细胞悬液
 
      ①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12－24h，进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。
 
      ②消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，（用PBS洗1－2遍），用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。
 
      2.3接种细胞
 
      ①取细胞悬液100μl加入Transwell小室。
 
      ② 24孔板下室一般加入600μl含20S的培养基，特别注意的是，下层培养液和小室间常会有气泡产生，一旦产生气泡，下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了，在种板的时候要特别留心，一旦出现气泡，要将小室提起，去除气泡，再将小室放进培养板。
 
      ③培养细胞：常规培养12－48h（主要依癌细胞侵袭能力而定）。24h较常见，时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外，处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。
 
      2.4结果统计
 
      直接计数法，“贴壁”细胞计数，这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后，可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去，通过给细胞染色，可在镜下计数细胞。
 
      取出Transwell小室，弃去孔中培养液，用无钙的PBS洗2遍，甲醇固定30分钟，将小室适当风干。
 
      0.1%结晶紫染色20 min，用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞，用PBS洗3遍。
 
      400倍显微镜下随即五个视野观察细胞，记数。
 
      实验周期
      1个月
 
      服务周期
      1-2个月
 
      收费标准
      欢迎询价详谈

流式细胞仪进行细胞周期检测（PI）

     细胞周期的定义生命 是从一代向下一代传递的连续过程，因此是一个不断更新、不断从头开始的过程。细胞的生命开始于产生它的母细胞的分裂, 结束于它的子细胞的形成，或是细胞的自身死亡。通常将通过细胞分裂产生的新细胞的生长开始到下一次细胞分裂形成子细胞结束为止所经历的过程称为细胞周期。 在这一过程中，细胞的遗传物质复制并均等地分配给两个子细胞。

      PI染色的检测
      PI能够插入双链DNA中。它被活细胞排斥但能穿透正在死亡或已经死亡的细胞的细胞膜。

      PI单染色的固定方法：
      1．收集细胞（1～5）×106个，500～1000r/min离心5min，弃去培养液。
      2．3ml PBS洗一次。
      3．离心去PBS，加入冰预冷的70％的乙醇固定，4℃，1h。
      4．离心弃去固定液，3ml PBS重悬5min。
      5．400目的筛网过滤1次，500～1000r/min离心5min，弃去PBS。
      6．用1ml PI染液，4℃避光30min。
      7．流式细胞仪检测：PI用氩离子激发荧光，激发光波波长为488nm，发射光波波长大于630nm，产生红色荧光，可分析前散射光对侧散射光的散点图及PI荧光的直方图。
 
 
      （1）材料：
      1、PI（e.g.,Cat #537059,Calbiochem,San Diego,CA）
      2、缓冲体系：1×PBS(Ca2+ and Mg2+ free,e.g.,Cat#9240,Irvine Scientific,Santa Ana,CA)+2%新鲜小牛血清＋0.1%叠氮钠

      A、  PI缓冲液
      用缓冲液将PI溶解至终浓度为1mg/ml中，于4℃下密封避光保存1个月。
      B、  PI浓缩液
      用缓冲液将PI溶解至终浓度为500mg/ml，于4℃下密封避光保存。我们已经检测过将PI浓缩液放置数月后，并无观察到染色活性的丢失。


      （2）方法：
      将样品细胞按程序描述的方法用FITC标记的单克隆抗体进行单色染色。
      A、  在最后的洗涤步骤后，将样品细胞悬浮于PI缓冲液中，于4℃下密封避光保存以备通过流式细胞仪分析；
      B、  在最后的洗涤步骤后，如前述将样品细胞悬浮后备用。如果您想检测样品细胞活力，在每一管中加入2μl的PI浓缩液，混匀。将样品置于4℃下密封避光保存以备流式细胞仪分析。

      服务周期
       20个工作日

      收费标准
      欢迎询价详谈

联系人：曲经理

电话：18910586739

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