DNA提取及常见问题分析上海延慕实业有限公司

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技术服务信息

服务名称:DNA提取及常见问题分析
服务类别:分子生物学服务 - DNA提取/纯化
价格:询价
允许参观:不允许参观
所在区域:上海.上海
更新时间:2016-12-7 8:34:00
浏览人数:69
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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技术服务详细描述

DNA是遗传信息的载体,是最重要的生物信息分子,是分子生物学研究的主要对象,因此DNA的提取是分子生物学实验技术中最重要、最基本的操作 。
DNA提取的几种方法

染色体DNA的提取
CTAB法
SDS法
其它


非染色体DNA的提取
质粒DNA的提取
碱裂解法
煮沸法


线粒体、叶绿体DNA的提取
差速离心结合SDS裂解法

基因组DNA- CTAB法

CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)

CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合物。

该复合物在高盐溶液中(>0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离出来。
注:CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的
        植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。

基因组DNA- CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方

组份     Tris-HCl   (pH8.0)     EDTA (pH8.0)     NaCl     CTAB    β-***
终浓度     100 mM      20 mM     1.4M    2%(W/V)    0.1%(V/V)使用前加入

Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;
NaCl 提供一个高盐环境,使DNP充分溶解,存在于液相中;
CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;
β-***是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除

CTAB提取缓冲液的改进配方

组份     Tris-HCl (pH8.0)     EDTA (pH8.0)    NaCl     CTAB     PVP40    β-***
终浓度     100 mM      20 mM    1.4M    3%(W/V)    5%(W/V)    2%(V/V)使用前加入

PVP(聚乙***)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多糖结合,有效去除多糖。

SDS法原理
SDS是一种阴离子去垢剂,在高温(55~65℃)条件下能裂解细胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;
提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度(冰浴),使蛋白质及多糖杂质沉淀,离心后除去沉淀;
上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA。

SDS法DNA提取缓冲液
组份    Tris-HCl (pH8.0)     EDTA (pH 8.0 )     NaCl       SDS
终浓度      10 mM       20 mM       0.4M       2%

DNA提取常见问题
问题一:DNA样品不纯,抑制后续酶解和PCR反应。
原因:
DNA中含有蛋白、多糖、多酚类杂质
DNA在溶解前,有酒精残留,酒精抑制后续酶解反应
DNA中残留有金属离子
对策:
重新纯化DNA,去除蛋白、多糖、多酚等杂质(具体方法见前)
重新沉淀DNA,让酒精充分挥发
增加70%乙醇洗涤的次数(2-3次)

问题二:DNA降解。
原因:
材料不新鲜或反复冻融
未很好抑制内源核酸酶的活性
提取过程操作过于剧烈,DNA被机械打断
外源核酸酶污染
反复冻融
对策:
尽量取新鲜材料,低温保存材料避免反复冻融
液氮研磨或匀浆组织后,应在解冻前加入裂解缓冲液
在提取内源核酸酶含量丰富的材料的DNA时,可增加裂解液中螯合剂的含量
细胞裂解后的后续操作应尽量轻柔
所有试剂用无菌水配制,耗材经高温灭菌
将DNA分装保存于缓冲液中,避免反复冻融

问题三:DNA提取量少。
原因:
实验材料不佳或量少
破壁或裂解不充分
沉淀不完全
洗涤时DNA丢失
对策:
尽量选用新鲜(幼嫩)的材料
动植物要匀浆研磨充分;G+菌、酵母裂解前先用生物酶或机械方式破壁
高温裂解时,时间适当延长(对于动物细胞、细菌可增加PK的用量)
低温沉淀,延长沉淀时间
加辅助物,促进沉淀
洗涤时,最好用枪头将洗涤液吸出,勿倾倒

 

 

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