经典ES细胞基因敲除小鼠仁源生物技术(上海)有限公司

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技术服务信息

服务名称:经典ES细胞基因敲除小鼠
服务类别:实验动物服务 - 转基因动物定制服务
价格:90000元
允许参观:协商决定
所在区域:上海.上海
更新时间:2016-12-8 16:28:00
浏览人数:210
诚信指数:57点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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仁源生物技术(上海)有限公司
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021-34781526
联系人:
吕磊
所在区域:
上海·上海
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技术服务详细描述

基因打靶小鼠的制备流程分为三个步骤:
(1)基因打靶载体的构建
基因打靶载体由三部分组成:
(a)同源臂:一般来说,同源臂越长,其发生正确同源重组的效率也越高。但是,过长的同源臂往往会造成后续阳性ES细胞克隆筛选的困难。我们的经验是:左右同源臂长度之和尽量在6-8kbs之间,两个同源臂长度尽量不要相差太大,4kbs-4kbs,3kbs-5kbs都比较合适。
(b)筛选基因:我们一般使用NEO基因作为筛选基因,当然PURO基因与HYGRO基因也较常用。同时我们使用LoxP与Frt序列的组合,可以在ES阳性细胞克隆中或基因敲除小鼠中方便地将筛选基因移除。
(c)载体质粒骨架。打靶载体对质粒骨架并无特定要求,常用的克隆载体如pUC系列质粒均可以使用。另外,我们目前采用的策略,可以实现只用一个基因打靶载体,最终获得包括报告基因(EGFP)小鼠、完全基因敲除小鼠、条件型基因敲除小鼠在内的三种小鼠模型。



(2)ES细胞转染与阳性ES细胞克隆的筛选。
平台目前使用两种小鼠ES细胞系:E14tg2a与JM8A3,分别源自129/Ola与C57BL/6N小鼠品系。基因打靶载体需要首先经限制性内切酶切线性化后,方被电转(Electroporation)入小鼠ES细胞。与其它转染方法相比,采用电转的方式可以有效降低多个基因打靶载体同时整合入ES细胞基因组,并且对ES细胞刺激较小,利于后续ES细胞的生殖系嵌合。我们一般挑取192~288(2~3×96孔板)个G418抗性ES克隆,利用长片段PCR的方法进行同源重组阳性ES细胞克隆的筛选。长片段PCR筛选所选取的引物须分别设计在NEO基因与上下游的同源臂之外,因此只有发生正确同源重组的阳性ES细胞才能够扩增出大小合适的目的片段*(*也可以根据客户要求对PCR获得的阳性ES细胞克隆进行Southern Blot验证),并通过测序对扩增出的PCR产物进行验证。此外,制备条件型基因敲除小鼠时,需要对两个LoxP位点进行测序确认,排除丢失远端LoxP位点的ES细胞克隆*(*我们的经验,当第2个LoxP位点离NEO基因的距离为3Kbs时,约有2/3的发生正确同源重组的ES克隆会丢失远端的LoxP位点)。
 
(3)囊胚显微注射与嵌合小鼠的获得。
为确保成功率,我们一般会选择2~3个独立的阳性ES细胞克隆进行下一步的囊胚显微注射。小鼠3.5天的胚胎位于子宫内,尚未着床,胚胎中有空腔,是为囊胚(Blastocysts)。ES细胞经显微注射入C57BL/6小鼠囊胚腔后,继而移植到假孕ICR母鼠的子宫中, 15~17天后小鼠降生。小鼠出生1周后即可初步观察到毛色,2-3周后毛色清楚呈现。如果注射的ES细胞系为E14,则好的嵌合鼠的毛色为棕色(Agouti),并伴有部分奶油色。如果注射的ES细胞系为JM8A3,则好的嵌合鼠的毛色为棕色(Agouti)。嵌合率一般的小鼠会出现棕色与黑色相间的毛色,嵌合率低的小鼠则多呈现为黑色毛色。选取毛色嵌合率高的雄性嵌合小鼠*(*由于ES细胞多为雄性,因此如果出现雌性的嵌合鼠,则说明ES细胞没有整合入生殖系;也有报道部分ES细胞丢失了y染色体,因而呈现雌性嵌合鼠表型。)与雌性C57BL/6小鼠交配,下一代小鼠毛色如出现棕色毛色,则说明ES细胞已经成功地整合入嵌合小鼠的生殖系细胞中。在棕色毛色小鼠中,有一半的小鼠会携带有同源重组基因。

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