蛋白质N端测序

     表达纯化后的蛋白产物，特别是蛋白品的分析过程中，需要对蛋白的末端进行验证，以保证表达纯化产物的N端和C端序列准确。Edman降解法是蛋白的N端序列分析中非常成熟的方法之一，得到广泛应用。易科学采用岛津公司最新推出的 edman测序系统，为广大科研工作者提供纯化后蛋白产物、蛋白品、抗体以及蛋白疫苗的N端测序服务。采用我们的测序系统，可以测定N端30个氨基酸的序列信息。采用特定的蛋白上样系统，我们最多可以测定N端的60-70个氨基酸。 

我们还通过LC-MS/MS技术进行N-端测序的平台，可以测出封闭和修饰的蛋白质末端，与Edman降解法形成互补，保证N端测序服务的顺利进行。

 可以对下列生物样品进行测序

1. 蛋白表达产物的验证：重组蛋白插入位点和表达顺序是否正确；蛋白品质量控制；

2. 细胞株建立和发酵过程中蛋白产物的验证：验证细胞株建立和发酵过程中蛋白产物N端甲硫氨酸和信号肽是否正确处理；

3. 蛋白降解/酶切分析：对降解/酶切形成的新蛋白片段N端进行分析，确定断裂/酶切位点；

4. De-novo测序：对于蛋白数据库中不存在的全新蛋白序列进行分析。

实验原理

如下图所示，每一个Edman测序循环包括3步：第一步是在碱性条件下，PITC与蛋白N端的游离氨基结合；第二步是在酸性溶液中，N端残基被切除；第三步是PITC结合的残基转化成为更为稳定的PTH残基，经过在线的HPLC分析，根据洗脱时间最终确定氨基酸种类。

 Edman测序反应过程

研究路线

Edman测序实验流程图

蛋白样品首先进行SDS-PAGE的分离，保证样品的纯度满足测序的要求；随后将SDS-PAGE上的蛋白样品转移到PVDF膜上;经过染色确定把蛋白条带并切出；Edman测序仪对得到的PVDF膜上的蛋白样品进行分析。

 样品要求

我们的技术平台可以对两种类型的样品进行分析：PVDF膜和溶液样品。

 PVDF膜类样品的准备过程

1.样品电泳和电转

(1)对蛋白样品进行1D或者2D跑胶

(2)将蛋白胶上的样品转移至PVDF膜上；注意：千万不要使用硝酸纤维素膜（Nitrocellulose membranes）

(3)在此过程中请佩戴手套和头套，避免自身角蛋白对测序结果的影响

2.PVDF膜的染色

(1)染色过程中可以使用考马斯亮蓝或者立春红对PVDF膜进行染色；注意：千万不要使用银染的方法进行染色

(2)染色完成之后，可以使用双蒸水对PVDF膜进行清洗

(1)如果转膜的缓冲液中含有甘氨酸，需要对PVDF膜进行多次冲洗，以避免甘氨酸对后续分析的影响

(2)更详细的样品准备步骤与，见Edman测序样品准备Protocol（下划线部分加入超链接）

3.靶蛋白条带获取

(1)PVDF膜染色后，靶条带清晰可见，用洁净的解剖刀将靶蛋白条带切下

(2)在蛋白量允许的情况下，可以准备2-3条靶条带以增加靶蛋白的量

4.样品运输

(1)密闭包装后，冰袋运输即可

 溶液样品的准备过程

1.蛋白的纯度和用量

(1)样品纯度要＞90%，样品需要量在1-10ug， 样品准备过程全程佩戴口罩和头套，避免角蛋白的影响。

(2)Buffer中不要使用表面活性剂，并尽可能降低溶液的盐浓度

(3)Tris, glycine, guanidine, glycerol, sucrose, ethanolamine, SDS, Triton, X-100, Tween和其他的去垢剂, ammonium sulfate 和其他的铵盐均会对后续的氨基酸鉴定产生影响，在样品准备过程中要避免使用

2.蛋白样品的运输

(1)液体样品推荐干冰运输

(2)液体样品也可以在冷冻抽干或者真空抽干后，冰袋运输

服务周期及报价

服务周期：5-10个工作日

报价：￥180/氨基酸

 结果展示

项目完成之后，我们会提供英文版的技术报告。并提供鉴定的氨基酸的详细信息。