超级增强子lncRNA芯片服务

简介

    超级增强子lncRNA（SE-lncRNA）是一类由超级增强子区域转录而来的lncRNA。该lncRNA与超级增强子一起，调控特定细胞谱系发育和身份决定过程中的基因表达。SE-lncRNA与多种疾病有关，许多病理性表型都伴随着SE-lncRNA表达水平的显著变化[1-3]。SE-lncRNA表达水平检测对于研究超级增强子活性、功能机制和疾病相关性都十分必需。Arraystar公司开发了市场上首款SE-lncRNA芯片，可同时对SE-lncRNA以及受其调控的编码基因进行全面、系统的表达检测。Arraystar SE-lncRNA芯片目前包含人和小鼠两个版本。 

参考文献

1. Bradner JE, Hnisz D, Young RA: Transcriptional Addiction in Cancer. Cell 2017, 168(4):629-643.[PMID: 28187285]

2. Alvarez-Dominguez JR, Knoll M, Gromatzky AA, Lodish HF: The Super-Enhancer-Derived alncRNA-EC7/Bloodlinc Potentiates Red Blood Cell Development in trans. Cell Rep 2017, 19(12):2503-2514.[PMID: 28636939]

3. Xiang JF et al: Human colorectal cancer-specific CCAT1-L lncRNA regulates long-range chromatin interactions at the MYC locus. Cell Res 2014, 24(5):513-531.[PMID: 24662484]

4. Vucicevic D et al: Long ncRNA expression associates with tissue-specific enhancers. Cell Cycle 2015, 14(2):253-260.[PMID: 25607649]

5. Hon CC et al: An atlas of human long non-coding RNAs with accurate 5' ends. Nature 2017, 543(7644):199-204.[PMID: 28241135]

6. Soibam B: Super-lncRNAs: identification of lncRNAs that target super-enhancers via RNA:DNA:DNA triplex formation. RNA 2017, 23(11):1729-1742.[PMID: 28839111]

芯片特点

强大而可靠的SE-lncRNA收集与鉴定方法

• lncRNA信息来自Arraystar公司所专有的高质量的转录组与lncRNA数据库

- 收集整理了Refseq, UCSC knownGene, GENCODE, lncRNAdb, RNAdb, NRED和lncRNA Catalogs等权威数据库中的lncRNA

- 收集了注释完善、经过实验验证和有Pubmed索引的“金标准”lncRNA

- 手动收集了权威期刊上新出现的lncRNA

• 超级增强子区域信息来自dbSUPER数据库
• Mapping到超级增强子区域的lncRNA被鉴定为SE-lncRNA

图1. Arraystar SE-lncRNA芯片内容收集流程图。

一块芯片同时检测SE-lncRNA及其靶基因的表达水平，可直观、精确的找到二者之间的调控关系

针对特定的外显子或剪接区域设计探针，特异性的区分SE-lncRNA的不同isoform（图2）；灵敏度高，可检测到细胞中的单拷贝转录本

图 2. 探针#2可特异性的检测isoform CCAT1-L。

提供超级增强子、超级增强子lncRNA与其靶基因的详尽注释信息

图 3. SE-lncRNA注释信息示例。

高效的标记方法保证了SE-lncRNA定量检测的高灵敏度和高精确性

       超级增强子一般具有稳定性差、半衰期短的特点。它们能以极低的拷贝数发挥顺式作用，激活靶基因的表达。比如，SE-lncRNA HOTTIP可激活HOXA基因簇，其在细胞中的平均拷贝数少于1。

       为了精确地检测这些瞬时、低水平的SE-lncRNA，Arraystar科学家开发了一套高效的线性扩增方法，能够为多聚腺苷化或非多聚腺苷化的转录本产生足量的荧光标记cRNA。在此过程中，将分别携带有T7聚合酶启动子序列的oligo(dT)和随机引物以最优的比例混合，与RNA一起退火，合成cDNA第一链，随后与5’接头一起退火，合成双链cDNA，然后进行PCR扩增。最后，由T7 RNA聚合酶进行体外转录，合成带有Cy3或Cy5标记的cRNA（图6）。

       该标记方法极大的增加了低丰度或降解RNA分子的cRNA产物，比传统方法提高了100多倍。

图6. Arraystar公司 cRNA标记流程。(1) cDNA第一链合成与5’接头退火。 以携带有T7聚合酶启动子序列的oligo(dT)和随机引物混合物为反转引物，合成cDNA第一链，并与5’接头退火，合成cDNA第二链。(2) PCR扩增。使用RT引物和5’接头对双链cDNA进行低循环数的PCR扩增。(3) 体外转录和标记反义RNA (aRNA)。以Cy3或Cy5标记的核苷酸为底物，双链cDNA为模板，使用T7 RNA聚合酶进行体外转录，合成带有荧光标记的反义RNA。线性扩增保留了原始转录本的相对水平和完整序列，且无3’偏好性。

数据库

人SE-lncRNA芯片参数

图4. Arraystar公司人SE-lncRNA芯片内容。

小鼠SE-lncRNA芯片参数

图5. Arraystar公司小鼠 SE-lncRNA 芯片内容。

实验流程

1.样品总RNA抽提

      若实验对象为组织样品，取适量（50-100mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），匀浆后抽提RNA。
      若实验对象为细胞样品，每份样品取1×106~1×107细胞，完全吸去培养液后加1ml的RNA抽提试剂Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
2. RNA质量检测
       使用Nanodrop测定RNA在分光光度计260nm、280nm和230nm的吸收值，以计算浓度并评估纯度。
       使用甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度及完整性
3. cDNA样品合成和cRNA标记
4.标记效率质量检测
       使用Nanodrop检测荧光标记效率，以保证后续芯片实验结果的可靠性。
5.芯片杂交
       在标准条件下将标记好的探针和高密度芯片进行杂交。
6.图像采集和数据分析
       使用GenePix 4000B芯片扫描仪扫描芯片的荧光强度，并将实验结果转换成数字型数据保存，使用配套软件对原始数据进行分析运算。
7.提供实验报告
       芯片扫描图
       实验方法中英文报告
       RNA质检报告
       芯片数据结果报告，包括差异表达SE-LncRNA列表，差异表达基因列表

上海康成生物工程有限公司 

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