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QPCR

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产品名称: QPCR

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上海锐赛生物技术有限公司
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 实验原理

实时荧光定量PCR技术(Real-time Quantitative PCR,qPCR)是指在PCR反应体系中加入可与DNA产物特异性结合的荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最终通过相对定量或绝对定量的方法确定各个样本的本底表达量。qPCR所使用的荧光化学试剂可分为两种:荧光染料和荧光探针。

荧光染料SYBR Green:嵌入到双链DNA分子后构象发生变化,能够吸收497nm的激发光并发出520nm的荧光;而不掺入DNA双链中的染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步,见图 4.1。

图 4.1 SYBR Green 荧光染料法qPCR检测原理图

 

TaqMan 荧光探针:扩增时加入一个特异性的寡核苷酸荧光探针,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq 酶的 5'-3外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步,见图 4.2。

图 4.2 TaqMan 荧光探针法qPCR 检测原理图

 

 

SYBR GREEN 法和 TaqMan 探针法的区别

方法

优点

缺点

应用

SYBR GREEN 

方便快捷,不必针对各

个基因设计合成TaqMan

探针,具有价格优势。

无模板特异性,对引物特异性要求较高,需进行熔解曲线分析;灵敏度相对较低。

应用于基因的差异表达分析,比RNA干扰效果确认。

TaqMan 探针法

荧光化合物标记到特异

性的寡核苷酸上,具有高度特异性,重复性好,荧光信号强。

只适合一个特定的目

标,探针价格较高。

通常应用于基因拷贝数的确定,在临床诊断中最常用,比如病毒和病原菌定量检测。

 

 

 

技术应用

 

定量方法

原理

技术应用

绝对定量

(Absolute QuantificationAQ)

是测定目的基因在样本中的分子数目,即通常所说的拷贝数。

病原体检测;

转基因食品检测;

基因表达研究。

相对定量

(Relative Quantification

RQ)

测定目的基因在两个或多个样本中的含量的相对比例,而不需要知道它们在每个样本中的拷贝数。

基因在不同组织中的表达差异;药物疗效考核;耐药性研究。

 

 

实验流程


 

 

 

 

 

实物

数据信息

实验周期

客户提供

样本

靶基因NCBI登录号

4

我们提供

基本实验步骤、EXCEL原始数据扩增线,溶解曲线

 

 

 

实验结果展示

 

1)目的基因          

                                                        

 

2)内参基因

 

 

 

3)柱形图

图 4.3  A、B 两种细胞经加药处理后目的基因在各个时间点的qPCR相对定量表达量检测

1)目的基因的扩增曲线与熔解曲线;2)内参基因的扩增曲线与熔解曲线 ;

3)目的基因在 A、B 两种细胞加药处理后各个时间点的表达量柱形图(2-ΔΔCt相对定量数据处理)。

 

 

扩增曲线和溶解曲线的常见术语:

 

基线

Baseline

PCR扩增反应的最初数个循环里,荧光信号变化不大,接近一条直线,即称为基线。

荧光域值

Threshold Value

一般将PCR反应前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号,荧光域值3-15个循环荧光信号标准差的10 倍,荧光域值设定在PCR扩增的指数期。

Ct 

Threshold Cycle

扩增产物的荧光信号进入指数增长期时所经历的循环数。模板的Ct与起始拷贝数的对数存在线性关系,起始拷贝数越多,Ct 值越小。

熔解曲线Tm

Tm Of Melting Curve

SYBR Green染料发实验结束后需对qPCR产物加热,随着温度的升高,双链接扩增产物逐渐解链,导致荧光强度下降,到达某一温度时,会导致大量的产物解链,荧光急剧下降,将此温度称为Tm值。不同PCR产物Tm值不同,从而可对PCR的特异性进行鉴定。

 

 

TROUBLESHOOTING

实验问题

原因

推荐解决方法

Ct 值起跳过晚

引物设计不佳

重新设计引物,RT—PCR