凝胶迁移或电泳迁移率实验广州莱博生物科技有限公司

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技术服务信息

服务名称:凝胶迁移或电泳迁移率实验
服务类别:科研实验整体外包服务 - 实验设计指导服务
价格:1元
允许参观:允许参观
所在区域:广东.广州
更新时间:2018/9/6 9:09:00
浏览人数:50
诚信指数:148点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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技术服务详细描述

    凝胶迁移或电泳迁移率实验      


 
凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA-electrophoretic mobility shift assay)是一种研究DNA结合蛋白和其相关的DNA结合序列相互作用的技术,可用于定性和定量分析。这一技术最初用于研究DNA结合蛋白,目前已用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。 通常将纯化的蛋白和细胞粗提液和32P同位素标记的DNA或RNA探针一同保温,在非变性的聚丙烯凝胶电泳上,分离复合物和非结合的探针。DNA-复合物或RNA-复合物比非结合的探针移动得慢。同位素标记的探针依研究的结合蛋白的不同,可是双链或者是单链。当检测 如转录调控因子一类的DNA结合蛋白,可用纯化蛋白,部分纯化蛋白,或核细胞抽提液。在检测RNA结合蛋白时,依据目的RNA结合蛋白的位置,可用纯化或部分纯化的蛋白,也可用核或胞质细胞抽提液。竞争实验中采用含蛋白结合序列的DNA或RNA片段和寡核苷酸片段(特异), 和其它非相关的片段(非特异),来确定DNA或RNA结合蛋白的特异性。在竞争的特异和非特异片段的存在下,依据复合物的特点和强度来确定特异结合。
 
EASA实验步骤:    
 
1. 探针的标记
 
探针为含有与蛋白特异结合的中心盒,大约20 bp左右,使用pierce公司的3’末端标记试剂盒(PIERCE,Rockford,IL,USA)标记。操作步骤参照说明书,具体步骤如下:
   1) 将试剂盒中除TdT以外的其他组分解冻并置于冰上。迅速稀释TdT:Sx TdT Reaction Buffer 2 u1,超纯水7 ul 20 U/ul TdT 1 ul。稀释后得到1 Xdiluted TdT(2 U/ul),稀释后的TdT必须现配现用,稀释后不能保存。
   2) 反应体系:5x TdT buffer 10 ul,DNA 5 pmol,Biotin-ll-UTP 5 ul,diluted TdT5 ul,超纯水补足50 ul。在37℃温浴3 0 min,加入2/5体积0.2 M EDTA,终止反应。加入等体积氯0仿:异戊醇(24:1)抽提TdT,涡悬充分,高速离心3 min,取上层即为标记探针,分装后-80℃保存。
 
2. 非变性电泳

   1) 非变性电泳:30%丙稀酸胺2.66 ml,TBE(5X)2 ml,10%过硫酸按1.4 ml,TEMED7 ul,双蒸水补足20 ml。按照上述配方配置4%的非变性胶。在烧杯中迅速混匀,置于冰上,灌胶,待凝胶聚合后拔出梳子,用双蒸水洗点样孔,再用0.5xTBE清洗点样孔。
   2) 样品准备:按照不同的组合加入DNA和蛋白,另外还需要加入结合缓冲液,如果是粗蛋白还需要加入poly(dI.dC)(试剂盒中有)抑制非特异性条带的产生。
   3) 电泳:预跑胶30-60 min,100 V。上样。跑胶,100 V,30 min左右。注意电泳要在冰上完成,以防止电泳时产生热量使不稳定的复合物解离。
   4) 转膜:电泳跑好后,将胶取下,放在大小相似的尼龙膜上,上下各加一层润湿的blotting paper,放到半干转移装置上,100 V,380 mA,转膜1 h。
   5) UV交联:取出膜。在紫外交联仪中999.9 mJ,固定10 min。
   6) 洗膜:
      a. 将Blocking Buffer和4XWash Buffer置于37-50℃使其溶解。
      b. 用20 ml of Blocking Buffer封闭膜,温浴15 min,摇床轻摇。
      c. 在20 ml Blocking Buffer中加入66.7 ul Stabilized Streptavidin-Horseradish Peroxidase Conjugate(1:300稀释),配置成conjugate/blocking solution。
      d. 将膜从blocking buffer中取出,在conjugate/blocking solution中轻摇15 min。
      e. 将4XWash Buffer用双蒸水稀释成1 Xwash solution。
      f. 将膜置于新的培养皿,用20 ml 1 Xwash solution冲洗。
      g. 用1 Xwash solution洗膜4次,每次5 min,摇床轻摇。
      h.在新培养皿中加入30 ml Substrate Equilibration Buffer,将膜放入,温浴5 min,摇床轻摇。
      i. 将6 ml Luminol/Enhancer Solution和6 ml Stable Peroxide Solution避光置于锡箔纸包好的烧杯中,摇匀,作为Substrate Working Solution。
      j. 将膜从Substrate Equilibration Buffer中取出,用滤纸尽量吸去液体,放入新的培养皿。
      k. 将Substrate Working Solution用枪慢慢加到膜上使液体尽量到达整张膜,静置5min。
      l. 取出膜,控制膜不能干燥。
      m. 用保鲜膜将膜包好,不能有气泡。
      n. 在暗室中,将膜放入曝光盒,用X-ray胶片压片,曝光时间随温度变化而不同,室温一般1 min。然后将胶片取出,经过显影,水洗和定影可以看到实验结果,如果胶片长期保存一定要在水龙头底下长时间冲洗,晾干后可拍照。
 
您只需要提供:

1、客户提供组织、细胞,公司提取核蛋白并进行蛋白浓度测定;
2、客户提供核蛋白,公司进行蛋白浓度测定;
3、客户提供已知浓度的核蛋白,公司进行EMSA实验。

 
我们将为您提供:

   样品质检报告、实验数据分析、实验方法及样品EMSA电泳图。

收费标准/服务周期/提供结果:

   欢迎咨询详谈,我们会根据您的方案及需求制定详细的服务协议。
   更多实验技术服务请浏览网站其他内容,或来电咨询!

 

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