免疫荧光

细胞免疫荧光染色
免疫荧光：1.材料准备
1)盖玻片.载玻片
盖玻片 水洗 浸泡于75％的乙醇溶液
超声波 泡酸
载玻片 水洗 无水乙醇浸泡 烘干
2）试剂
a.固定液: 4％甲醛， 4％多聚甲醛（PBS，72度溶解）
b.透膜液：0.2％或0.3％triton X-100, 甲醇＋丙酮（V：V＝1：1）
c.封闭液：5％BSA
以上试剂除甲醇＋丙酮外均用PBS配制
d.一抗：Rabit-anti-HA（1:500） ,Mouse-anti-myc（ 1:500）,
Mouse-anti-flag（1:1500),
e.二抗：
Goat-anti-Rabbit FITC(1:500) , Goat-anti-Rabbit-Mouse Texas(1:500）
一抗二抗 均用封闭液稀释
f. Hoechst 5ug/ml PBS稀释
g. 90％甘油溶于PBS
h . 指甲油
2. 盖玻片处理
在细胞培养之前为了让某些细胞（例如293，293T）的贴壁性能提高需对盖玻片进行处理，常用的处理方法有：
A：凝胶（gelatin）处理：
1.配制2%的凝胶水溶液，高压灭菌（同时也有助于凝胶的溶解）
2.将适量盖玻片（一般不超过40片）放入10cm的细胞培养盘
3.加入10ml 2%的凝胶溶液放在脱色摇床上，在室温下shake1小时。
4.将200ul的25％的异戊二醛加到10ml的新配制的1xPBS
5.吸去凝胶溶液，加入新配制的异戊二醛溶液，室温下摇15分钟。
6.用PBS洗5次，每次5分钟。
7.将盖玻片放在30mm盘或者是六空板，UV照射1小时，备用。
B：多聚赖氨酸处理
1.将洗干静的盖玻片放在40 μg/ml多聚赖氨酸处理溶液中，室温下浸泡大约1小时
2.自来水冲洗1小时，然后用蒸馏水浸泡3次，每次5分钟。
3 UV照射3小时，备用。
3.细胞培养
根据细胞的不同生长速度而调节分细胞时的密度，一般说来，在细胞固定前其密度达到1X106
为宜1X106
4.转染
为了检测某种蛋白分子的细胞内定位或者观察两种蛋白分子在细胞内的共定位，常常将某基因转染进入细胞内，常用的有PEI，磷酸钙转染法等。
5.染色
1).转染24hr后，吸去培养液，PBS洗一次
2).固定： 4％甲醛或 4％多聚甲醛， 20min， PBS洗二次
3).透膜：a. 0.2％或0.3％triton X-100, RT，10min ,PBS洗二次
b.甲醇＋丙酮（V：V＝1：1）, -20 °, 20min, PBS洗三次
4).封闭：封闭液800ul， RT，60min （时间可以长些，4° ）
5).一抗：100ul ,RT ，1hr 或者37 °，45min，PBS洗5次，5min/time
6).二抗：100ul ,RT ，1hr 或者37 °，45min，PBS洗2次，5min/time
7).染核：Hoechst，200ul,10min, PBS洗4次，5min/time
8).封片：9ul 90％甘油. 不要留有气泡。
6. 荧光显微镜观察