细胞凋亡整体解决方案深圳市拓普生物科技有限公司

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技术服务信息

服务名称:细胞凋亡整体解决方案
服务类别:科研实验整体外包服务 - 整体实验服务外包
价格:询价
允许参观:协商决定
所在区域:广东.深圳
更新时间:2020/1/21 9:46:00
浏览人数:32
诚信指数:507点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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技术服务详细描述

概念

细胞凋亡,也称为程序性细胞死亡,是机体为维持内稳态、正常发育,清除冗余,损坏或感染的细胞的一种主动生理过程,也是一种防御机制。

特征

细胞凋亡发生时会有形态生化改变的显著特征。形态变化主要体现在细胞皱缩,体积变小,细胞质膜起泡,到凋亡晚期时出现凋亡小体。凋亡小体包裹着细胞器和细胞核碎片,它们被巨噬细胞、薄壁细胞所吞噬,被吞噬溶酶体所降解,因而避免炎症反应的发生。生化改变的典型特征是染色体的固缩和DNA片段化。核小体间连接区的双链DNA片段化后其大小均为寡核小体DNA长度(180-200bp)的整倍数,因而在琼脂糖凝胶电脉中呈现规则的“梯子”形(DNA ladder)。“DNA ladder”的出现可作为判别细胞凋亡的特异性指标,但若未检出“DNA ladder”,亦不能排除凋亡的可能。



凋亡途径

细胞凋亡可以在不同的刺激下诱导发生,在哺乳动物中,细胞凋亡信号通路主要分为4类:

l  线粒体通路:主要由多种压力信号,例如,DNA化学损伤,UV辐射,生长因子缺乏等引起,也称内源细胞凋亡通路;

l  死亡受体途径:由细胞表面的受体信号所介导,也称外源细胞凋亡通路;

l  T细胞参与的细胞死亡途径:此通路中,颗粒酶A或颗粒酶B均可诱导凋亡;

l  内质网通路:当内质网的蛋白折叠功能受到影响时,未折叠蛋白反应(UPR)将会被激活,继而引发凋亡。

这四条信号通路既相互独立又互相交叉,其核心的执行者都是一类蛋白:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)。



细胞凋亡检测方法

1.        检测Caspase切割法

Caspase是一类与凋亡密切相关的蛋白水解酶家族,一般在细胞中以酶原形式存在,只有在凋亡情况下,才会发生蛋白切割而激活。所以通过检测Caspase的切割条带,来表针凋亡的发生。小编前面也讲到凋亡发生时,DNA会片段化,需要DNA修复酶来对DNA进行修补。PARP(poly ADP-ribose polymerase)就是一种DNA修复酶,它也是Caspase的切割底物,当它被切割时,同样能说明凋亡的发生。


2.        检测Bcl-2家族蛋白表达

线粒体凋亡途径可以通过Bcl-2家族蛋白来调节和控制。Bcl-2家族蛋白控制线粒体膜的通透性从而影响细胞色素c的释放,它们有的是促凋亡的,有的是抑制凋亡的,若促凋亡蛋白(BaxBad)表达量上升,同时抗凋亡蛋白(Bcl-2Bcl-2表达量下降,也能说明凋亡发生。由于Bcl-2家族蛋白还参与其他通路,如细胞自噬通路。一般Bcl-2家族蛋白表达情况与凋亡其他检测指标同时使用,增加说服力。


3.        检测p53蛋白表达

p53是一种抑癌基因,其生物学功能是在G期监视DNA的完整性。如有损伤,则抑制细胞增殖,直到DNA修复完成。如果DNA不能被修复,则诱导其凋亡。在依赖p53蛋白的细胞凋亡中,p53蛋白能特异性地抑制Bcl-2的表达,但对Bax的表达有明显的促进作用,在这些细胞中,p53的积累和活动引发了细胞凋亡。


4.        检测细胞色素c的释放

细胞色素c参与线粒体通路。随着凋亡的进行,细胞色素c会从线粒体中释放到细胞质中,所以检测时,细胞质中的细胞色素c会增加,线粒体中的细胞色素c会减少。


5.        Annexin VPI双染法检测细胞凋亡

在正常细胞中,***脂酰丝氨酸(PS)只分布在细胞膜脂质双层的内侧,而在细胞凋亡早期,细胞膜中的***脂酰丝氨酸(PS)由脂膜内侧翻向外侧。Annexin V一种***脂结合蛋白,与***脂酰丝氨酸有高度亲和力。因此Annexin V被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。Annexin V进行荧光素FITC标记后,可作为荧光探针,利用流式细胞仪可检测细胞凋亡的发生。***化丙***(Propidium Iodide, PI)是一种核酸染料,它不能透过完整的细胞膜,但对凋亡中晚期的细胞和死细胞,PI能够透过细胞膜而使细胞核染红。因此将Annexin VPI匹配使用,就可以将处于不同凋亡时期的细胞区分开来。


6.        TUNEL法检测细胞凋亡

细胞凋亡中,染色体 DNA 双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性 3'-OH 末端,可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT)的作用下,将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性***酸酶或生物素形成的衍生物标记到 DNA 3'-OH末端,这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL)。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有 DNA 的断裂,因而没有 3'-OH 形成,很少能够被染色。TUNEL 实际上是分子生物学与形态学相结合的研究方法,对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色,能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征,常用于组织的细胞凋亡检测。


通常情况下,需要联合使用多种检测手段增加说服力,如通过WB检测Caspase的自切割,对PARP的切割,Bcl家族蛋白的变化,通过流式检测细胞水平上的凋亡情况,通过TUNEL检测动物水平上的凋亡情况。

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