蛋白质磷酸化修饰类别、富集和鉴定方法北京百泰派克生物科技有限公司

技术服务信息

服务名称:蛋白质磷酸化修饰类别、富集和鉴定方法
服务类别:蛋白相关服务 - 蛋白分析服务
价格:200元
允许参观:允许参与实验
所在区域:北京.北京
更新时间:2020/8/13 16:50:00
浏览人数:42
诚信指数:5点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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技术服务详细描述

导读

• 蛋白质***酸化修饰定义?
• 蛋白质***酸化修饰类别?
• 蛋白质***酸化鉴定方法有哪些?
• 蛋白质***酸化肽段富集方法?

在哺乳动物细胞生命周期中,大约有1/3的蛋白质发生过***酸化修饰,在脊椎动物基因中,约有5%的基因编码的蛋白质是参与***酸化和去***酸化过程的蛋白激酶和***酸酶。它可以通过激发、调节诸多信号通路进而参与调控生物体的生长、发育、逆境应激、疾病发生等多种生命过程,一直是生物学研究的重点与热点。

1. 蛋白质***酸化

蛋***酸化是指在激酶催化作用下把ATP或者GTP的***酸基团(P04)转移到不同种类的氨基酸上(主要包括丝氨酸S、苏氨酸T、酪氨酸Y),从而使蛋白质发生翻译后修饰的过程。

蛋白质***酸化可以通过激发、调节诸多信号通路进而参与调控生物体的生长、发育、逆境应激、疾病发生等多种生命过程,一直是生物学研究的重点与热点。
图1. 蛋白质***酸化修饰反应

2. ***酸化修饰类型

根据***酸氨基酸残基的不同,可将***酸化蛋白质分为4类,即O-***酸盐蛋白质、N-***酸盐蛋白质、酰基***酸盐蛋白质和S-***酸盐蛋白质。
• O-***酸盐蛋白质通过羟氨基酸(如丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)的***酸化形成
• N-***酸盐蛋白质通过精氨酸、赖氨酸组氨酸的***酸化形成
• 酰基***酸盐蛋白质通过天冬氨酸或谷氨酸的***酸化形成
• S-***酸盐蛋白质通过半胱氨酸***酸化形成
到这里,不得不提起如何鉴定***酸化蛋白的修饰位点以及类别?

3. ***酸化蛋白质组学分析鉴定方法

1. Western Blotting
免疫印迹技术是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的、根据特定抗原-抗体的特异性反应来检测复杂样品中的某种蛋白质的免疫生化分析方法。
技术优势特点
• 检测特异性高
• 能够特异鉴定单个***酸化位点
• ***酸化鉴定受***酸化抗体限制,高效特异性的***酸化抗体制备较难;新发现的***酸化位点往往缺乏有效的***酸化检测抗体

2. 同位素标记(Isotope Labeled)结合免疫印迹法
此方法的原理是当蛋白发生***酸化时,***性32P的掺入和分子质量变化引起的凝胶迁移(gelshift),再通过免疫印迹方法检测同位素标记,从而达到鉴定***酸化蛋白的目的。

技术优势特点
• 检测技术灵敏并且直观
• 常用于体外***酸化反应结果检测
• ***酸化鉴定不受抗体限制
• 可同时分析多个蛋***酸化

3. Mn2+-Phos-tag SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
Mn2+-Phos-tag SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳通过连接在丙烯酰胺分子上的双核金属(如Mn2+)配合物对***酸基团的亲和,造成***酸化蛋白迁移的滞留,再将电泳结果转移到PVDF膜上,用相应蛋白的抗体识别,根据迁移滞留检测蛋***酸化。

蛋白质***酸化可以通过激发、调节诸多信号通路进而参与调控生物体的生长、发育、逆境应激、疾病发生等多种生命过程,一直是生物学研究的重点与热点。
图2. 丙烯酰胺铰链Phos-tag作用原理

技术优势特点
• 无***危害
• 鉴定不受限于特异性识别蛋白质***酸化的抗体
• 适用于大规模***酸化蛋白分析
• 与质谱鉴定兼容,进行更为精细的分析鉴定

4. 质谱鉴定法
在质谱分析中,先使试样中各组分电离生成不同荷质比的离子,然后经加速电场的作用,生成离子束,进入质量分析器。在质量分析器中,在磁场的作用下,质荷比相同的离子会被聚焦到同一点上,不同质荷比的离子聚焦于不同点上,因此获得区分不同质荷比离子的质谱图。与未经修饰的肽段相比,***酸基团修饰的肽段在相对分子质量上就会增加79.983,由此在质谱图中能够与未修饰肽段进行区分。

蛋白质***酸化可以通过激发、调节诸多信号通路进而参与调控生物体的生长、发育、逆境应激、疾病发生等多种生命过程,一直是生物学研究的重点与热点。
图4. TiO2富集***酸化肽段原理

固相金属亲和色谱IMAC
固相金属离子亲和色谱利用的是***酸基团与固相化的金属离子有高亲和力,可有效吸附***酸化基团,从而达到富集***酸化肽段的效果。鳌合底物上的金属离子通常是Fe3+或Ga3+,可以选择性地与***酸化肽中的***酸部分相结合,并且在高pH或***酸缓冲液中***酸化肽可以释放出来。但是这个方法不能够有效富集不与IMAC结合的***酸化肽段。

pY-1000基序抗体富集
高亲和性抗体可以从复杂混合物中免疫沉淀特定的蛋白,选择性分离***酸化蛋白。其中,酪氨酸***酸化蛋白质的单克隆抗体是已知的较好的检测***酸化蛋白质的抗体,它具有较强的亲和力,可以有效地免疫沉淀酪氨酸***酸化的蛋白质。并且酪氨酸***酸化的相对比例极低,只占***酸组的1%,但在肿瘤领域和细胞信号转导方向却是重中之重。用上述TiO2和IMAC方法很难富集到,目前利用基序抗体在肽段水平上免疫富集酪氨酸***酸化是分析此***酸化的首选方法。

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