还有这样，目的条带傻傻分不清

面对这些残忍的现实时，我们该怎么抉择？重复一次？换个蛋白？换个抗体？显然这些方案都不是更佳的方案。

为了避免出现以上问题，现在就给大家梳理一下western blot中常见问题以及对应的解决方案。

1、条带形状不好看怎么回事？

可能的原因有：

◐ 凝胶的不均匀或聚合不好，应对策略---灌胶前将溶液充分混匀。

◐ 样本盐浓度较高，应对策略---样本进行除盐或者将样本盐浓度调成一致。

◐ 缓冲液多次使用，导致成分发生变化，应对策略---重新配制。

◐ 凝胶下部有气泡，应对策略---电泳前先赶走气泡。

◐ 电泳时温度过高，应对策略---降低电流或电压。

2、没有条带是怎么回事？

可能的原因有：

◐ 二抗的HRP活性太强，将底物消耗光，应对策略---降低二抗的浓度。

◐ ECL底物中H2O2不稳定，失活，应对策略---更换ECL。

◐ ECL底物没有覆盖到相应的位置，应对策略---重新洗膜之后再次曝光。

◐ 一抗使用不当或者二抗失效，应对策略---在有效期内使用抗体，并对应来源。

3、背景高咋回事呢？

可能原因有：

◐ 洗膜不充分，应对策略---建议增加洗液体积和洗涤次数。

◐ 封闭不彻底，应对策略---提高封闭液的浓度，孵育时间，保证封闭液完全浸没转印膜。

◐ 封闭物使用不当，比如检测生物素标记的蛋白时不可以用脱脂奶粉，应对策略---针对不同的蛋白使用不同的封闭物。

◐ 抗体非特异性结合，应对策略---可以降低抗体的浓度或者减少孵育的时间。

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