扫描电镜/透射电镜/激光共聚焦

扫描电镜

扫描电镜取材要求：

由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。
在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。

小提示：

透射电镜标本先应用超薄切片机（Ultrotome）进行切片，再经戊二醛和饿酸双重固定，丙酮脱水，环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸枸椽酸电子又重染色，透射电镜观察。

扫描电镜标本经戊二醛和饿酸双重固定，乙醇逐级脱水，CO2临界点干燥，真空喷金，扫描电镜观察。

透射电镜

透射电子显微镜在材料科学、生物学上应用较多。由于电子易散射或被物体吸收，故穿透力低，样品的密度、厚度等都会影响到最后的成像质量，必须制备更薄的超薄切片，通常为50～100nm。所以用透射电子显微镜观察时的样品需要处理得很薄。

常用的方法：超薄切片法、冷冻超薄切片法、冷冻蚀刻法、冷冻断裂法等。对于液体样品，通常是挂预处理过的铜网上进行观察。

样本制备方法：

由于电镜电子束穿透能力的限制，必须把标本切成厚度小于0.1um以下的薄片才适用，这种薄片称为超薄切片。常用的超薄切片厚度是50-70nm。
    在透射电镜的样品制备方法中，超薄切片技术是最基本、最常用的制备技术。超薄切片的制作过程基本上和石蜡切片相似，需要经过取材、固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等步骤。
取材的基本要求
组织从生物活体取下以后，如果不立即进行适当处理，会由于细胞内部各种酶的作用，出现细胞自溶现象。此外，还可能由于污染，微生物在组织内繁殖使细胞的微细结构遭受破坏。因此，为了使细胞结构尽可能保持生前状态，必须做到快、小、准、冷：
(1)．动作迅速，组织从活体取下后应在最短时间内(争取在1分钟内) 投入2.5%戊二醛固定液。
(2)．所取组织的体积要小，一般不超过1mm×1mm×1mm。也可将组织修成1mm×1mm×2mm大小长条形。因为固定剂的渗透能力较弱，组织块如果太大，块的内部将不能得到良好的固定。
(3)．机械损伤要小，解剖器械应锋利，操作宜轻，避免牵拉、挫伤与挤压。
(4)．操作最好在低温(0℃～4℃)下进行，以降低酶的活性，防止细胞自溶。
(5)．取材部位要准确。
取材方法：将取出的组织放在洁净的蜡版上，滴一滴预冷的固定液，用两片新的、锋利的刀片成“拉锯式”将组织切下并修小，然后用牙签或镊子将组织块移至盛有冷的固定液的小瓶中。如果组织带有较多的血液和组织液，应先用固定液洗几遍，然后再切成小块固定。

免疫荧光染色

主要原理是利用抗原抗体之间的特异性结合来显示目的蛋白，主要包括蛋白和一抗结合，其次是带有荧光基团的二抗识别并结合一抗，在激光共聚焦系统下即可观察到荧光。染色程序分为两步，第一步，用已知未标记的抗体（Anti LC3II）加到未知抗原样本上；第二步，加上荧光标记的抗球蛋白抗体或抗IgG、IgM抗体（Anti Alexa Fluor 647）。如果第一步发生了抗原抗体反应，荧光标记的抗球蛋白抗体就会和已结合抗原的抗体进一步结合，从而可鉴定抗原。

我公司可以提供单标、双标及三标的免疫荧光服务。

激光共聚焦

激光共聚焦扫描显微镜（laser confocal scanning microscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。

激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。

高内涵活细胞成像

高内涵细胞成像分析系统由三个部分组成：全自动高速显微成像，全自动图像分析和数据管理。全自动高速显微成像在短时间内生成大量的图像，全自动图像分析从这些图像中提取大量的数据，数据管理软件负责建档存储、注释比较、检索分享这些图像和数据。

高内涵技术最初应用于药物筛选，随着技术的进步和发展，近年来在生命科学研究中得到了广泛的应用，包括细胞信号通路，肿瘤学，神经生物学，免疫学，传染病学，干细胞的研究等等。HCA提供的信息不可能从传统方法中获得，很多实验用高内涵平台来完成，比现有的方法更灵敏，通量更高，成本更低，结果更准确和可靠。

其中高内涵筛选(HCS)是一套自动化分析方法，利用整合的显微镜、图像处理技术及可视化工具从细胞或细胞群中提取数据，获得定量分析结果。HCS一般应用于高通量的样品荧光成像，提供定量分析结果。此外，HCS能够结合单个细胞的多重检测结果，同时分析单次实验中的多个细胞亚群。

高内涵筛选的技术优势：

• 高内涵筛选可在保持细胞结构和功能完整性;
• 同时检测被筛样品对细胞形态、生长、分化、迁移、凋亡、代谢途径及信号转导等各个环节的影响;
• 在单一实验中获取大量相关信息，确定其生物活性和潜在毒性。

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