iTRAQ/SILAC/DIGE/蛋白表达纯化

iTRAQ技术服务

定量蛋白质组学技术概述：

1、基于2-DE的染料染色方法的定量策略：

考染、银染、荧光染色。

考然和银染的灵敏度、动态范围、准确性差。

荧光染色的灵敏度和准确性比较好。

2、基于质谱技术的定量策略

3、非标记的定量策略: Spectrum Count，MRM

4、标记定量策略：iTRAQ，iCAT， SILAC

iTRAQ标记定量技术原理

 iTRAQ试剂为可与氨基酸N端及赖氨酸侧链连接的胺标记同重元素(isobaric)。在质谱图中，任何一种iTRAQ试剂标记的不同样本中的同一蛋白质表现为相同的质荷比。
在串联质谱中，信号离子表现为不同质荷比(114～117)的峰，因此，根据波峰的高度及面积，可以得到蛋白质的定量信息。 

iTRAQ标记定量技术实验流程：

样品→酶解→标记→混合→质谱→数据分析

iTRAQ标记定量技术样品制备

☆需要蛋白量：每个样品至少100ug 

☆全蛋白：直接加入裂解液匀浆或超声，或者液氮研磨后加入裂解液。注意裂解液中不能含有Tris，硫脲等含有游离氨基的试剂。

☆亚细胞器蛋白：匀浆后差速离心或超速离心分离亚细胞器，再用裂解液裂解亚细胞器。

☆血浆等含有高峰度蛋白的样品：需提前去除高峰度蛋白。

蛋白定量一定要尽量准确。

☆酶解前用丙酮沉淀去除样品中的尿素等变性剂，再用试剂盒提供的buffer重溶蛋白。

☆标记前标记试剂用50-60ul异丙醇悬起，肽段的浓度应该在2-5ug/ul，肽段溶液的体积与标记试剂中异丙醇的体积之比不能高于2：3。

☆标记结束后先用MALDI-TOF检测标记的情况，如果不好可再加一遍标记试剂

☆确认标记成功后将各样品混合在一起，用SCX分离成10-20个组分。所用的液相体系为KH2PO4+KCl。

☆用C18再将所有组分脱盐、抽干、重溶。

☆用MALDI检测每个组分的肽段组成情况，组成接近的或者肽段含量少的合并到其他组分中。

iTRAQ标记定量检测仪器

☆要求仪器精确度高，可测低质量端。

☆三级四极杆质谱，如ABI 公司的Q Star、Q Trap。

☆QTOF

☆LC-MALDI-TOF

iTRAQ标记定量结果分析：

分析软件：

Wrap-LC, Scaffold Q

分析流程：

质谱原始数据→软件提取每副质谱图的保留时间、峰强度、碎片离子质量信息→生成mjf、xml等格式的文件→数据库检索→根据一个或多个unique 肽段的报告离子的强度变化计算出蛋白丰度的变化倍数→归一化处理→软件提取搜索结果中匹配肽段的保留时间、报告离子的强度等信息。

iTRAQ技术主要特点： 

1、分离能力强、分析范围广 

2、定性分析结果可靠，可以同时给出每一个组分的分子量和丰富的结构信息 ，MS具备高灵敏度、检测限低 ，分析时间快，分离效果好 ，自动化程度高 

3、TRAQ技术不仅可发现胞浆蛋白，还有膜蛋白、核蛋白、胞外蛋白 

4、iTRAQ技术可检测出低丰度蛋白、强碱性蛋白、小于10KD或大于200KD的蛋白

iTRAQ技术-样品准备： 

蛋白运输：24小时内可以4度运输 

蛋白长期保存：-20度 

待检测蛋白要求：蛋白量最低50ug，浓度最低要 为5ug/uL 10ul 

蛋白提取试剂要求：使用普通的组织、细胞裂解液即可，切忌不要使用二维电泳试剂提取。

注意事项： 

☆客户所提供的待测蛋白量最低要求50ug，浓度最低要为5ug/uL，否则准确度低。

☆或者您直接提供组织或细胞，后续操作全部由我们来做。 

☆itraq服务您只需要提供样本，其他试剂都无需提供。

SILAC技术服务

SILAC 的是分别用天然同位素(轻型)或稳定同位素(重型)标记的必需氨基酸取代细胞培养基中相应氨基酸，细胞经 5-6 个倍增周期后，稳定同位素的氨基酸完全掺入到细胞新合成的蛋白质中替代了原有氨基酸。不同标记细胞的裂解蛋白按细胞数或蛋白量等比例混合，经分离、纯化后进行质谱鉴定。

技术优势

· 该技术属于体内标记，标记效果稳定，细胞在传代6-8代之后，蛋白标记效率可达90%以上。其标记效率不受裂解液的影响，不仅适合与进行全细胞蛋白的分析，还适合膜蛋白的鉴定与定量。

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