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过表达载体构建

过表达载体构建

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产品名称: 过表达载体构建

英文名称: Overexpression vector construction

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和元生物技术(上海)股份有限公司
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人Oct-4过表达载体构建

摘要:以人cDNA为模板扩增Oct-4基因并构建入慢病毒载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro。该载体骨架中EGFP-3FLAG与目的基
因融合表达以利于后续的表达观测和Western Blot研究,而puromycin抗性基因则利于稳定细胞株的筛选。该载体既可用于瞬时转染细胞,
也可以包装成慢病毒用于稳定株的筛选以及在动物水平过表达Oct-4基因。
关键词:Oct-4,过表达,EGFP-3FLAG, puromycin, lentivirus vector

一、 实验原理
PCR扩增Oct-4基因序列,构建于pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体CMV-EGFP序列间的EcoR I多克隆位点,目的基因和EGFP-3FLAG序列融合表达。pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro载体图谱如下:

                                                           

二、 实验目的
构建既可用于瞬时转染又可用于慢病毒包装和稳定株筛选的Oct-4基因过表达慢病毒载体。

 

三、 实验方法
PCR扩增的Oct-4基因序列与经EcoR I酶切后的表达载体pLenti-CMV-EGFP-3FLAG-PGK-Puro片段同源重组后转化E.coli  DH5α感受态细胞。菌落PCR筛选到的阳性克隆送测序。经验证无误的进行质粒抽提。实验步骤如下:
1. 引物设计:
从GenBank中查询目的基因以及上下游的序列,用Vector NTI软件进行引物设计。
PCR扩增目的基因:
使用高保真的PrimeSTAR酶扩增目的基因,反应体系和条件如下:

 

         
2. 琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增结果:
目的基因PCR扩增成功后,进行琼脂糖凝胶电泳检测,通过和DNA Marker的对比,判断目的基因是否扩增成功。
3. 胶回收目的基因片段:
把目的基因条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收,具体步骤参考试剂盒说明书。
4. 线性化表达载体的制备:
用限制性内切酶对表达载体进行酶切,酶切反应体系为:质粒2μg,10 x反应Buffer 5μl,限制性内切酶各1μl,去离子水补足50μl,于37℃水浴锅中孵育2h以上。酶切产物进行进行琼脂糖凝胶电泳检测酶切效果,并把目的载体条带从琼脂糖凝胶电泳后的胶中割下来,用TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver.3.0做胶回收。
5. 目的基因同源重组到线性化表达载体中:
将目的DNA片段和线性化载体以摩尔比2:1加到离心管中进行重组反应:

     
 混匀后在42℃孵育30min,然后转移到冰上。静置2-3min后取10μl反应液体转化到感受态细胞中。

6. 感受态细胞的制备和转化:
DH5α感受态细胞的制备和转化,详见《精编分子生物学实验指南》¬。¬
7. 菌落PCR鉴定阳性转化子:
挑取平板上长出的转化子重悬于10µl LB培养液中,取1µl作为模板进行菌落PCR鉴定。反应体系和PCR循环条件如下:

    
 8. 阳性克隆送测序:
菌落鉴定得到的阳性克隆,送测序公司进行测序验证。软件比对测序结果并分析。
9. 质粒小提:
经测序验证正确的阳性克隆,安排质粒小提。具体步骤见试剂盒说明书。

四、 实验结果
1. PCR扩增目的基因:
用正向引物CTCAAGCTTCGAATTCGCCACCATGGCGGGACACCTGGCT(含同源重组序列、EcoR I酶切位点、Kozak序列,并含有目的基因5’端配对序列用于PCR扩增目的基因),反向引物CCATGGTGGCGAATTCGTTTGAATGCATGGGAGAGC(引物说明:含同源重组序列、EcoR I酶切位点,并含有目的基因3’端配对序列用于PCR扩增目的基因)对人cDNA进行扩增,预期PCR产物大小为1126 bp,电泳结果如下:
                                                1    2               3     4

                                             

 

 

 

1. PCR产物
2. DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp
2. 表达载体的线性化:
用EcoR I对表达载体进行双酶切,胶回收4801bp的载体片段,酶切图谱如下:
                                                    1     2

                                                 
 1. 载体片段
2. 1kb DNA ladder Marker:10 kb、8kb、6kb、5kb、4 kb、3.5kb、3kb、2.5kb、2kb、1.5kb、1kb、750 bp、500 bp、250 bp
3. 菌落PCR鉴定阳性克隆
用菌落PCR鉴定转化子,正向引物CMV-F:CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG位于CMV启动子序列中,反向引物pEGFP-N-3   CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG位于EGFP基因的N端序列,阳性克隆得到1287bp的片段,空载体对照得到252bp的片断。电泳结果如下:
                                                 1   2    3    4    5   6   7    8    9   10  11

                                              
 1. 阴性对照(ddH2O)
2. 阴性对照(空载体)
3. DL2,000 DNA  Marker: 2 kb, 1 kb,750 bp,500 bp,250 bp,100 bp
4-11.  挑取的8个转化子
接种阳性克隆,保种并分装100μl送测序。经验证序列无误的,抽提质粒。

4. 测序结果分析
阳性克隆测序结果表明,和预期序列完全一致。

         
 五、 参考文献
1. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社