Real time PCR 技术服务 

荧光定量PCR概述

　　聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)自诞生之日起就决定了它不仅是一种高敏感、高特异的检测核酸分子的定性方法，而且也是一个能对核酸分子进行精确定量的有力工具。随着分子生物学技术研究的不断进展，定量PCR技术取得了突飞猛进的发展，实时定量PCR (real-time quantitative PCR)技术便是一种具有革命性意义的定量PCR技术。所谓实时定量PCR是指在PCR指数扩增期间通过连续监测荧光信号强弱的变化来即时测定特异性产物的量，并据此推断目的基因的初始量。

　　目前实时定量PCR作为一个极有效的实验方法，已被广泛地应用于分子生物学研究的各个领域，仅2000-2001年，收录在Medline上的以real-time PCR为关键词的文章就达1000多篇。实时PCR技术较之以前的以终点法进行定量的PCR技术具有无与伦比的优势。首先，它不仅操作简便、快速高效，而且具有很高的敏感性和特异性。其次，由于是在封闭的体系中完成扩增并进行实时测定，大大降低了污染的可能性并且无须在扩增后进行操作。

　　实时荧光定量PCR技术即是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。实时荧光定量PCR避免了传统PCR以终产物检测定量产生的偏差，提高实验的重复性。该技术已被广泛用于检测细胞mRNA表达量的变化；比较不同组织的mRNA表达差异；验证基因芯片，siRNA干扰的实验结果。

复申为您提供全套实时荧光定量PCR技术服务，全部实验皆使用进口试剂完成。

1、主要实验步骤如下：

（1）．  根据基因序列设计特异性引物

（2）．  客户样品RNA抽提：

（3）．  RNA质量检测

（4）．  逆转录为CDNA

（5）．  制备标准曲线

（6）．  Real time PCR扩增

（7）．  实验数据分析

2、服务须知：

（1）. 您可自备引物，亦可委托我们设计合成（费用由客户承担）。自备引物必须是PAGE纯化的高质量的干粉，我们不接受已溶解的引物。内参及SYBR Green染料我公司提供。

（2）. 样本要求：尽可能新鲜

（3）. 样本量：组织样本，质量≥150mg；细胞样本，细胞数≥1×107。样本制备及注意事项:

 ①悬浮细胞： 悬浮细胞培养液倒入离心管中，离心沉淀细胞，弃去上清液。加入1ml PBS悬浮细胞，转入小离心管中，低速离心沉淀细胞，弃去PBS，将细胞沉淀（1×107个细胞）放入-70℃ 冰箱保存。干冰运输。也可以在细胞沉淀中加入1ml的 Trizol 裂解液反复吸打几次，目视可见细胞层溶解完全后，-70℃保存效果更佳。

 ②贴壁细胞：取大约1×107个贴壁细胞，胰酶消化后加入PBS悬浮细胞，低速离心收集，弃去液体，加入 1 ml PBS悬浮细胞，转入小离心管中，低速离心沉淀细胞，弃去PBS，放入-70℃冰箱保存。干冰运输。也可以在细胞沉淀中加入1ml的 Trizol 裂解液反复吸打几次，目视可见细胞层溶解完全后，-70℃保存效果更佳。

 ③组织：采集新鲜组织（注意：生物体死亡后1分钟内取材料并保存好），组织块以PBS或生理盐水清洗干净，切为小块，放入液氮或-70℃冰箱中保存，干冰运输。也可每 50-100 mg 组织加1 ml Trizol溶液匀浆裂解组织样品。匀浆的裂解液4℃ 短期保存（1个月）。-20℃或-70℃长期保存。

（4）. 我公司不接受您提供的RNA样品，除非您有足够的证据证明所提供的RNA没有问题。

3、实验项目及费用：

    生物为您提供准确、快速的实时定量检测服务，特异性强、灵敏度高。