Tunel(凋亡)实验北京代做技术支持
产品名称： Tunel(凋亡)实验北京代做技术支持
英文名称： Tunel
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使用范围： null
北京冬歌博业生物科技有限公司
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实验方法
编辑
对于贴壁细胞或细胞涂片
a. PBS或HBSS洗涤一次。
b. 如果细胞贴得不牢，可以干燥样品使细胞贴得更牢。
d. 用PBS或HBSS洗涤一次。
e. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。
f. 转步骤5。
对于悬浮细胞或细胞悬液
a. 收集细胞(不超过200万细胞)，PBS或HBSS洗涤一次。
b. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水
平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
c. 用PBS或HBSS洗涤一次。
d. 用含0.1% Triton X-100的PBS重悬细胞，冰浴孵育2分钟。
e. 转步骤5。
对于石蜡切片
a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。无水乙醇5分钟。90%乙醇2分钟。70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
b.滴加20μg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。
c. PBS或HBSS洗涤3次。注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
d. 转步骤5。
对于冷冻切片
a. 用4%多聚甲醛固定细胞30-60分钟。
b. PBS或HBSS洗涤2次，每次10分钟。
c. 加入含0.1% Triton X-100的PBS，冰浴孵育2分钟。
d. 转步骤5。
配制TUNEL检测液
参考下表配制适当量的TUNEL检测液，需充分混匀。注意：配制好的TUNEL检测液必须一次使用完毕，不能冻存。
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1个样品
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5个样品
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10个样品
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TdT酶
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2μl
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10μl
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20μl
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荧光标记液
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48μl
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240μl
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480μl
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TUNEL检测液
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50μl
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250μl
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500μl
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对于贴壁细胞、细胞涂片或组织切片
a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
b. 在样品上加50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少TUNEL检测液的蒸发。
c. PBS或HBSS洗涤3次。
对于悬浮细胞或细胞悬液
a. 用PBS或HBSS洗涤2次。
b. 加入50μl TUNEL检测液，37℃避光孵育60分钟。
c. PBS或HBSS洗涤2次。
d. 用250-500μl PBS或HBSS悬浮。
e. 此时可以用流式细胞仪进行检测或涂片后在荧光显微镜下观察。可以使用的激发波长范围为450-500nm，发射波长范
围为515-565nm(绿色荧光)。
常见问题编辑
出现非特异性荧光标记
a. 有些细胞或组织，例如平滑肌细胞或组织，nuclease或polymerase的酶活性水平较高，易导致出现非特异性的荧光标记。解决方法是，取细胞或组织后立即固定并且要充分固定，以阻止这些酶导致假阳性。
b. 使用了不适当的固定液，例如一些酸性固定液，导致出现假阳性。建议采用推荐的固定液。
荧光背景很高
a. 支原体污染。请使用支原体染色检测试剂盒检测是否为支原体污染。
b. 高速分裂和增殖的细胞，有时也会出现细胞核中的DNA断裂。
d. 红细胞中血红蛋白导致的自发荧光产生严重干扰。此时宜选择其它细胞凋亡检测试剂盒。
标记效率低
a. 使用乙醇或甲醇固定会导致标记的效率较低。
b. 固定时间过长，导致交联程度过高。此时宜减少固定时间。
c. 荧光淬灭。Fluorescence在普通光照10分钟就会严重淬灭。解决方法是需注意避光操作。
d. 碘化丙啶双染时，如果碘化丙啶染色过深会导致观察到的本试剂盒的TUNEL染色效果减弱。碘化丙啶可以接受fluorescein激发产生的荧光，从而起到淬灭作用。解决方法是用较低浓度的碘化丙啶染色，例如0.5μg/ml碘化丙啶。