CRISPR-Pro完全性基因敲除小鼠是通过CRISPR /Cas9基因敲除技术，针对靶基因设计和构建gRNA与Cas9表达质粒，造成目的基因的功能区域被敲除，获得全身所有的组织和细胞中都不表达该基因的小鼠模型。

CRISPR-Pro完全性基因敲除包括：移码突变、片段基因敲除、双/多基因敲除。

移码突变鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建相应的gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代阳性小鼠；

2、F0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子鼠；

3、选择来自同一只F0代小鼠，基因型一致的F1代小鼠，达到性成熟后进行互配，可获得F2代小鼠。对获得的F2代小鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代小鼠中25%为纯合子，50%为杂合子，25%为野生小鼠。

片段基因敲除小鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因不同位点设计、构建相应的一对gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代阳性小鼠；

2、F0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配，获得PCR鉴定阳性的F1代杂合子小鼠；

3、选择来自同一只F0代小鼠，基因型一致的F1代小鼠，达到性成熟后互配，可获得F2代小鼠。对获得的F2代小鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代小鼠中25%为纯合子，50%为杂合子，25%为野生小鼠。

双（多）基因敲除小鼠的建系原则与流程

1、通过针对两个靶基因分别设计、构建相应的gRNA质粒，体外转录为RNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代多基因杂合子小鼠；

2、F0代杂合子小鼠与野生型小鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代双基因杂合子小鼠；

3、选择双基因杂合子鼠进行杂交，获得F2代小鼠。对获得的F2代鼠进行PCR及测序鉴定。

条件性基因敲除是通过把两个LoxP位点插入到目的基因的一个或几个重要外显子的两端以制备出有两个floxed小鼠。该floxed小鼠在与表达Cre重组酶小鼠杂交之前，该基因表达正常；当floxed小鼠与组织特异性表达Cre酶的小鼠进行杂交后，可实现在特定的组织或细胞中敲除该基因，而在其它组织或细胞中该基因表达正常。

建系原则与流程：

1、与野生型小鼠杂交：阳性CRISPR-Pro小鼠（+/flox）与野生型小鼠（+/+）杂交，获得F1代杂合子小鼠（+/flox）；

2、挑选一对F1代杂合子小鼠（+/flox）进行自交，获得F2代纯合子小鼠（flox/flox）。

CRISPR-Pro基因敲入小鼠是利用CRISPR/Cas9基因敲入技术，针对靶基因设计、构建相应的 gRNA质粒和donor vector，通过Cas9核酸酶的切割作用和同源臂的同源重组，引入特定的突变或外源基因。比如在目的基因上引入点突变(模拟人类遗传疾病模型)或将报告基因(如EGFP，mRFP，mCherry，mYFP，或LacZ等)引入目的基因的特定位点，从而可以通过报告基因来跟踪目标基因的表达；也可以用报告基因取代大小鼠本身的基因，使KO/KI同时发生。

CRISPR-Pro基因敲入小鼠包括：点突变、片段基因敲入。

点突变鼠的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建gRNA质粒并转录为RNA，再合成含有突变位点信息的donor oligo，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代阳性小鼠；

2、F0代阳性小鼠与野生型小鼠进行交配，获得PCR和测序鉴定阳性的F1代杂合子小鼠；

3、  选择来自同一只F0代小鼠，敲入位点一致的F1代小鼠，达到性成熟后进行同胞交配，可获得F2代小鼠。对获得的F2代小鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代小鼠中25%为敲入位点一致的纯合子小鼠，有50%为只有一条染色体敲入的杂合子小鼠，有25%为野生型小鼠。

片段基因敲入的建系原则与流程

1、通过针对靶基因设计、构建gRNA质粒和含有突变位点信息的donor vector，将以上质粒转录为mRNA后，与Cas9 mRNA一起原核显微注射获得测序鉴定阳性的F0代阳性小鼠；

2、F0代阳性小鼠与野生型鼠进行交配，获得PCR鉴定基因型和测序鉴定随机插入的F1代杂合子小鼠；

3、  选择来自同一只F0代小鼠，敲入位点一致的F1代小鼠，达到性成熟后进行同胞交配，可获得F2代小鼠。对获得的F2代小鼠进行PCR及测序鉴定，理论上，F2代小鼠中25%为敲入位点一致的纯合子小鼠，有50%为只有一条染色体敲入的杂合子小鼠，有25%为野生型小鼠。

指在Rosa26位点插入某种基因的基因敲入小鼠模型（也称转基因小鼠模型）。Rosa26位点基因敲入小鼠模型不仅插入位点精准，同时由于Rosa26是安全区域，所以外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达；而且由于是单拷贝基因插入，因此更容易预测表达量；结合Cre-loxP系统，可使外源基因在特定组织及特定时间稳定表达，可用来高效构建多用途的条件性基因敲入小鼠模型，因此越来越受到科研人员的青睐。

构建原理图：

Rosa26位点基因敲入(基于CRISPR-Pro技术）

Rosa26位点条件性基因敲入(基于CRISPR-Pro技术）

构建流程：

技术优势：

1. 外源基因的重组位置确定，更有利于表达；

2. 结合Cre-loxP系统，可以使外源基因在特定组织及特定时间表达；

Rosa26是一个经典的基因插入位点，虽然对于Rosa26位点的研究较多，但制作多基因插入小鼠时仍需要其他合适的插入位点。H11（Hipp11）是另一个可供选择的插入位点，也是一个安全区域，在此位点的插入基因不会影响其他基因表达，同时此插入基因的表达也不会受到周边区域的影响。

H11位于小鼠 11 号染色体，是位于Eif4enif1与Drg1两个基因之间的一个位点，于 2010 年由 Hippenmeyer S.发现，整合到 H11 位点的外源基因可以稳定高效的表达。利用Crispr/Cas9基因编辑技术，可将外源的基因片段定点插入到小鼠的H11位点。与Rosa26相比，其优点是不受旁侧启动子影响，因此更合适用于表达外源基因。结合loxp系统，可构建组织特异性表达小鼠模型。

构建原理图：

构建流程：

技术优势：

1. 稳定性高，后代表达一致；

2. 实用性强，能实现A基因在Rosa26位点及B基因在H11位点同时过表达；

3. 经济实惠，F1代即可开始实验。

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