云序生物提供RIP测序服务，客户仅需提供细胞或组织样本及抗体，云序一站式提供免疫沉淀、分离纯化、测序或PCR及后续生信分析，快速找到与目标蛋白结合的RNA。

技术简介

RIP(RNA Immunoprecipitation)是研究细胞内RNA与蛋白结合情况的技术，是了解转录后调控网络的有力工具。这种技术运用针对目标蛋白的抗体把相应的RNA-蛋白复合物沉淀下来，然后经过分离纯化就可以对结合在复合物上的RNA进行分析。RIP-Seq将RIP技术与高通量测序相结合，能够高通量地检测与特定蛋白结合的RNA，从而解析全转录组范围内的目标蛋白-RNA相互作用网络。

云序优势

一站式服务：

客户只需提供细胞，组织或RIP RNA，云序生物为您完成从样品处理，文库制备，上机测序到数据分析整套服务流程。

商业化的RIP试剂盒：

RIP实验的成败是决定数据质量的关键，云序生物采用商业化RIP试剂盒，保证了RIP实验的成功率和稳定性。

严格的质控：

云序生物在实验的各个关键步骤加入了一系列质控点，全程监控实验质量，确保客户得到优质的数据。

专业化的生物信息分析：

云序生物具有强大的生物信息学团队，能够满足客户的各类深入数据分析要求。

样本要求

样品类型：

细胞、组织或IP后的RNA。其它类型样品请详询。

样品量：

a)细胞：5×10⁸

b)组织：500 mg

c)IP后的RNA： >1 μg，OD260/280≥1.8; OD260/230≥1.5 (无明显降解，电泳检测样品特征性条带完整清晰，无明显弥散或拖尾 )

样品运输及保存：

样品运输：样品置于1.5mL离心f管中，封口膜封好，干冰运输。

样品保存：细胞样品或新鲜组织块可用TRIZOL或RNA保护剂处理，液氮冻存后-80℃保存; RNA样品可溶于乙醇或RNA-free的超纯水中，-80℃保存，避免反复冻融。

数据分析

1、富集峰识别与注释

在RIP-Seq中，富集峰代表了所有活跃转录的区域(相对于对照IgG)。利用富集峰的注释绘制富集峰在不同基因组特征上的比例图。从总体上查看峰偏向的基因组特征。

2、差异富集区鉴定和注释

云序生物使用diffReps软件进行差异富集区(differentially enriched peaks，DEPs)鉴定。默认p-value<0.0001，fold change >=2.0作为差异阈值。(具体以报告为准)。

3、富集峰差异富集区相关基因Go分析

云序生物利用启动子区(TSS-2000-TSS+2000)差异富集峰对应的基因进行GO功能分析，以注释并推测这些富集峰(蛋白质)可能参与的功能。 P-value <= 0.05的GO terms被认为是统计显著的。

4、富集峰/差异富集区相关基因KEGG通路分析

KEGG PATHWAY是将基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学中的分子数据集映射到KEGG通路图上，以进行这些分子的生物学功能解释的过程。云序生物利用启动子区(TSS-2000 ~ TSS+2000)富集峰对应的基因进行通路分析，以注释并推测这些富集峰(蛋白质)可能参与的通路。以P-value <=0.05作为显著富集的阈值。

  

5、富集峰可视化

MACS产生了UCSC wig格式的可视化文件。该文件可以上传到UCSC Genome Browser以在基因组环境中直观地展示富集峰。云序生物使用50 bp分辨率进行富集峰可视化以供参考。

案例分析

案例1：解析RNA-蛋白相互作用

原文：Genome-wide Identification of Polycomb-Associated RNAs by RIP-seq

期刊：Molecular Cell 影响因子：14.27

Polycomb蛋白在干细胞分化和人类疾病中发挥着重要的作用。近期的研究表明：RNA分子可以作为共作用因子参与Polycomb抑制蛋白复合物2(PRC2)的形成。本文通过RIP测序在胚胎干细胞中找到了超过9000个与蛋白复合物PRC2相关结合的RNA分子。这些RNA中包括反义转录本，基因间转录本，基因启动子相关的转录本，以及很多未被注释的转录本。许多转录本来源于基因印迹区，癌基因或抑制基因位点或者是与干细胞相关的bivalent区域。这些结果说明：PRC2蛋白复合物广泛的与各类RNA结合，其中一些RNA可以作为人类疾病的分子标志物或是治疗靶点。

　　图1. 与PRC2蛋白复合物结合的RNA分类和统计

案例2：识别miRNA靶基因

原文：Genome-wide identification of translationally inhibitedand degraded miR-155 targets using RNA-interactingprotein-IP

期刊：RNA Biology 影响因子：5.22

miRNA可以通过降解靶mRNA或是抑制靶mRNA的翻译发挥调控作用。一个miRNA往往可以调控多个靶mRNA，因此在全基因组范围内系统性的研究miRNA的靶基因对准确解析miRNA的功能至关重要。仅通过miRNA表达谱和转录组分析并不能准确的确定miRNA靶基因。本文在过表达miR-155的HEK293T的细胞中，针对AGO2抗体进行了RIP测序，发现了100多个与AGO2蛋白结合的mRNA，其中有67个被预测为miR-155的靶mRNA。通过整合RIP测序和表达谱数据发现:这些靶mRNA有的通过mRNA降解被调控，有的则是通过翻译抑制被调控。

　　图2. 过表达miR-155细胞中显著性变化mRNA的散点图