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原代细胞培养服务:原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题服务

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产品名称: 原代细胞培养服务:原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题服务

英文名称: Primary cell culture

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原代细胞培养服务:原代肝细胞定制服务

原代细胞培养服务:原代细胞定制服务

原代细胞培养服务:原代细胞分离培养鉴定以及检测等整体课题服务

 

Case:新生SD大鼠原代心房肌细胞分离与药物刺激培养冰检测相关蛋白与基因


实验设计

一、细胞:分离大鼠原代心房肌细胞

二、细胞培养分组:
    a)对照组:正常大鼠原代心房肌细胞72h培养
    b)高糖72h培养
    c)高糖+氧化应激抑制因子72h培养
    d)正常培养48h+氧化应激刺激因子再培养24h
    e)高糖培养48h+氧化应激抑制因子再培养24h
    f)正常培养48h+(氧化应激刺激因子+氧化应激抑制因子)共同培养24h
三、蛋白检测:WB检测各组培养细胞中A蛋白与B蛋白的表达。
四、荧光定量检测:荧光定量PCR方法检测各组培养细胞中A基因与B基因的表达。


实验报告

一、新生SD大鼠心房肌细胞的分离与培养:
    1、无菌条件下,取出1-3d 龄SD大鼠心房组织,然后用PBS将此组织块清洗2次,最后将组织剪成1mm3左右大小;
    2、往组织块中加入4 mL酶消化液(0.1% 胰酶和0.1% I型胶原酶),混悬10s,置37℃条件下消化10min,之后用滴管吹打制成单细胞悬液,自然沉淀并收集上清,用含10% FBS培养基终止消化
后4℃放置;
    3、剩下的组织再加入3~4mL酶消化液,混悬10s,置37℃消化10 min后,按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置,重复此步骤2-3次,直至组织完全被消化;
    4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液,1200r/min 离心10min,弃去上清,沉淀细胞用含有10% FBS DMEM/F12培养基混悬,接种于25cm2培养瓶,放置于37℃ ,5%CO2 培养箱中培养;
    5、差速贴壁1h后,吸出培养基,按实验需要接种于6孔板中继续培养;


二、新生SD大鼠心房肌细胞的α-actin免疫荧光鉴定:
    1、待心房肌细胞生长至80%融合时,弃去培养基,用温育的PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min;
    2、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在4℃条件下,用0.1%Triton X-100透膜15min;
    3、PBS冲洗细胞2次,每次10min,然后在室温条件下,用4% BSA封闭细胞30min;
    4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗(Abbioscience公司),然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜;
    5、PBS冲洗细胞3次,每次10min,按1:150的比例稀释抗α-actin的二抗(嘉美生物公司), 37℃条件下放置1h;
    6、用PBS冲洗3次,每次10min,最后在倒置荧光显微镜(Leica公司)下观察图像并拍照。

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三、Real-time PCR检测SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A基因、B基因、FKBP12.6 mRNA表达水平
1、总RNA的提取:
   (1)将细胞培养液吸出后,用PBS洗细胞2次,加入1 mL Trizol室温裂解细胞5min,用移液器均匀吹下细胞并置于EP管中,上下轻柔颠倒10次,室温静置5min;
   (2)加0.2 mL氯仿,颠倒混匀10次,室温静置5min,4℃,12000rpm,离心20min;
   (3)转上层水相于另一新EP管中,加入等体积异丙醇,颠倒混匀10次,-20℃放置2h后,4℃,12000rpm,离心15min;
   (4)用移液器小心吸弃上清,加冰预冷的75%乙醇,4℃,12000rpm,离心10min;
   (5)弃上清,EP管倒扣,空气干燥10 min;
   (6)将总RNA溶于适量DEPC处理水中,最后用分光光度计测量其浓度。
2、第一链cDNA合成(Genecopoeia试剂盒)
   (1)反应体系(20μL):
    Total RNA  2μg
    Oligo (dT)18  1μL
    10mM dNTPs  1μL
    5×RT Buffer  4μL
    Ribonuclease Inhibitor  0.5μL
    TransScript RT  1μL
    ddH2O to final volume  20μL   

   (2)轻轻混匀后,进行:
    a) 42℃孵育30min.
    b) 85℃孵育5min.
    c) -20℃,保存备用.
3、Real-time PCR(Genecopoeia SYBR Green I 荧光染料试剂盒)
  (1)引物序列:
    a、CaMK-ⅡδF:CTGGCACACCTGGGTATCTT
       CaMK-ⅡδR:ATCCCAGAAGGGTGGGTATC
    b、A Gene F:TAACCTACCAGGCCGTGGAT
       A Gene R:GCTGCGATCTGGATAAGTTCAA
    c、B Gene F:GCAGTTGACTGAGGCGTCTT
       B Gene R:GGATTCGTGAGTGGCGATAC
    d、FKBP12.6 F:CTGGAATTCATGGGCGTGGAGATCGAG
       FKBP12.6 R:GACTCGAGTCACTCTAAGTTGAGCAGCTC
    e、β-actin F:GACGGTCAGGTCATCACTATCG
       β-actin R:ACGGATGTCAACGTCACACTTC
   (2)反应体系(25μL):
    F引物  0.5μL
    R引物  0.5μL
    SuperMix  12.5μL
    Passive Reference Dye  0.5μL
    cDNA  2μL
    ddH2O  9μL
   (3)程序设置如下(Eppendorf PCR仪):
    95℃       3min
    95℃       20s
    55℃       20s          40循环
    72℃       20s
    95℃       15s
    60℃       15s
    60℃-95℃  20min
    95℃       15s
   (4)Realplex软件导出数据并分析

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CAMK-II基因

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A基因

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B基因

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FKBP 12.6基因


四、WB检测新生SD大鼠心房肌细胞CaMK-Ⅱδ、A蛋白、B蛋白、FKBP12.6蛋白表达水平
1、实验材料
    PBS、细胞裂解液、PMSF、BCA试剂盒(嘉美生物)、5×蛋白上样缓冲液、脱脂奶粉,CaMK-Ⅱδ一抗(Abbioscience)、B蛋白一抗(Abbioscience)、FKBP12.6一抗(Abbioscience)、β-actin一抗
(Abbioscience)和B蛋白一抗 (Millipore)、山羊抗兔-HRP二抗(abcam)、ECL Reagent(嘉美生物)、显影剂、定影剂。
2、实验仪器
    细胞刮、1mL注射器、EP管、移液器、冷冻离心机、摇床、酶标仪、电泳器材、PVDF膜、电转器材、X光片、压片盒。
3、实验方法
   (1)细胞裂解液配制:基础裂解液中加入0.2mmol/L PMSF蛋白酶抑制剂。
   (2)蛋白样品制备:
        ①弃去六孔板细胞中的培养基。
        ②每孔细胞中加入2mL 4℃预冷的PBS,平放轻轻摇动2min洗涤细胞,然后弃去PBS洗液。重复以上操作。
        ③每孔加入100μL细胞裂解液在冰上对细胞进行裂解,然后用细胞刮将细胞刮下,最后将裂解液移入干净的EP管中。
        ④将EP管中细胞冰上裂解30min,在此期间用1mL 注射器对裂解液进行反复抽吸20次。 
        ⑤裂解完后,于4℃,12000rpm离心20min。然后将上清移入新的1.5mL EP管中,即为所需蛋白样品。
        ⑥每样本取3μL  蛋白提取液转入另外的EP管保存备定量用。向其余蛋白样品中加入其1/4体积的蛋白上样缓冲液,沸水煮5min,最后将其-80℃保存。
   (3)蛋白浓度测定:
         根据嘉美生物BCA试剂盒说明书中步骤进行实验。具体步骤如下:
        ①将0.5μg/μL 蛋白标准品按0、1、2、4、8、12、16ul加到96孔板中,然后将各孔用细胞裂解液补足到20μL。
        ②每样品加2μL 到96孔板的样品孔中,然后将各孔补加18μL 的细胞裂解液。
        ③各孔加人200μL BCA工作液(BCA试剂A: BCA试剂B=50: 1),37℃条件下放置30min。
        ④用酶标仪测定562nm波长处各孔的吸光度。最后根据标准曲线计算蛋白浓度。实验结果见后面结果部分内容。
   (4)SDS-PAGE电泳:
        ①配胶:CaMK-Ⅱδ(1.5mm 10%分离胶, 5%浓缩胶)、A蛋白、B蛋白(1.5mm 5%分离胶,4%浓缩胶)、FKBP12.6(1.5mm 15%分离胶,5%浓缩胶)
        ②上样:取制备好的蛋白样品,使用前沸水煮5min,12000rpm离心2min。各样本之间平衡后,每泳道上样45μL。
        ③电泳:浓缩胶60V,分离胶100V,溴酚蓝移动至玻璃板底端,提示电泳结束,关闭电源。
   (5)转膜:
        ①将PVDF膜放到甲醇中浸泡2min,然后把转膜海绵垫、滤纸、PVDF膜放置于电转液中平衡30min。
        ②将转膜夹打开,在代表负极的黑色面铺上一块湿润的海绵垫,再添加2层湿润的滤纸,将电泳好的SDS-PAGE分离胶小心地铺在滤纸上方,表面再覆盖大小合适的PVDF膜;然后再覆盖两层湿润
滤纸,再垫上湿润的海绵垫,最后将转膜夹的红色面与黑色面闭合好,将其放入转膜槽中相应的位置。
        ③转膜CaMK-Ⅱδ(100V,60min);A蛋白、B蛋白(100V,180min);FKBP12.6(80V,30min),转膜全过程在冰上进行。
        ④丽春红染色:转膜完成后,将膜从转膜夹中取出,立即投入丽春红染液中染色,大约染色3min 后将膜从丽春红染液中取出,用DDH2O轻轻冲洗膜,注意观察膜上的红色条带,当条带足够清
晰后停止水洗,根据蛋白Marker位置适当剪膜,留出目的蛋白所在的范围。最后用DDH2O彻底洗膜,尽可能洗去残留的丽春红染料。
   (6)封闭:室温条件下,5%脱脂奶粉+TBST在摇床上封闭1h。
   (7)一抗杂交:
        CaMK-Ⅱδ(1:500)、A蛋白(1:200)、B蛋白(1:50)、FKBP12.6(1:300)、β-actin(1:1000),4℃孵育过夜。
   (8)洗膜:TBST洗膜3次,每次10min。
   (9)二抗杂交:山羊抗兔-HRP二抗(1:2500),室温孵育1h。
   (10)洗膜:TBST洗膜3次,每次10min。
   (11)显影:
         首先,用滤纸吸去膜上的液体,将膜平放于保鲜膜上,将新鲜配置好的ECL Reagent滴加到膜面上,反应3min后用滤纸在膜的边缘尽量吸去多余的ECL Reagent,然后根据条带的亮度将膜放到
压片夹中曝光适当的时间,最后,显影、定影、冲洗胶片及对胶片进行扫描分析。

 


BCA试剂盒蛋白定量实验结果:
标准品OD值分别为:
0.488、0.519、0.559、0.603、0.668、0.759、0.884
LG组、NG组、HG组、HG+U组OD值分别为:0.646、0.677、0.671、0.698
ONOO组、DC-ONOO组、ONOO+U组OD值分别为:0.816、0.703、0.79、0.612

 

WB实验结果:

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嘉美生物是一家主要从事Annexin V,信号转导抗体,重组人和动物蛋白,磷酸化抗体,各种动物ELISA试剂盒,生物实验服务等研发与销售的高科技生物公司。