Western Blot北京爱思益普生物科技股份有限公司

技术服务信息

服务名称:Western Blot
服务类别:蛋白相关服务 - 其它
价格:,元
允许参观:允许参与实验
所在区域:北京.北京
更新时间:2017-4-26 12:00:00
浏览人数:218
诚信指数:295点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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供应商联系卡

北京爱思益普生物科技股份有限公司
地址:
北京亦庄经济技术开发区经海三路35号院德上科技园内4幢3层
邮编:
100176
电话:
010-67809840,18611172849
传真:
010-67809840
联系人:
李英骥
所在区域:
北京·北京
邮件:
公司展台:

技术服务详细描述

 Western blot检测方法

1)              制胶:灌制10%分离胶和5%浓缩胶。待浓缩胶凝固后,小心地拔出梳子,移入电泳槽,加电泳缓冲液。

2)              上样:各组样品加上样缓冲液并经99℃变性5 min,短暂离心后上样。样品上样量约50 μg,预染蛋白Marker上样量为5 μl

3)              电泳:将电泳槽与电源连接,起始电压80 V,待染料前缘进入分离胶后调电压至120 V。继续电泳至溴酚蓝到达分离胶底部。

4)              电转:电泳结束后,准备转膜。剪6张滤纸和1PVDF膜,其大小、形状与凝胶一致。PVDF膜先在甲醇中浸泡激活约20 sec,然后与滤纸一起放入电转液中平衡10 min。打开凝胶夹,以黑色板为阴极,从黑色板向上依次放入海绵、3张滤纸、凝胶、PVDF膜、3张滤纸、海绵。除去气泡夹紧凝胶夹,放入转移槽中,黑色板对准阴极,安装好转移装置,加入电转液,200 mA恒定电流,转移1-2 h

5)              封闭:电转结束后,把PVDF膜取出,浸泡在5%脱脂奶粉中,室温封闭1 h

6)              一抗孵育:用1%BSA按最佳比例稀释一抗,4℃孵育过夜。抗体稀释度分别为KCa1.1 (1:500) Homer 1a (1:500)Homer 1b/c (1:2000)β-Actin (1:10000)

7)              洗涤TBS-T洗涤3次,每次10 min

8)             二抗孵育:用1%BSA稀释HRP标记的二抗(山羊抗鼠IgG和山羊抗兔IgG稀释度均为1:10000,驴抗羊IgG稀释度为1:5000),与PVDF膜在室温下孵育约1 h

9)              洗涤TBS-T洗涤3次,每次10 min

10)          ECL法显色(暗室操作)

l      配制ECL工作液:取等体积的A液和B液混合,放置使之升到室温。

l      PVDF膜与工作液充分接触,室温孵育3 min

l      曝光:暗盒中铺一张保鲜膜,将PVDF膜去尽残液,贴在保鲜膜上,然后再覆盖一层保鲜膜。黑暗中放入X光胶片,压在包好的膜上。关上暗盒,开始计时,根据信号强弱适当调整曝光时间,一般为15 min

l      显影,定影:曝光完成后,打开暗盒,取出X光胶片,迅速浸入显影液中显影,待出现明显条带后,即刻终止显影。将X光胶片在水中冲洗一下,去掉显影液,然后浸入定影液中,定影时间一般为5~10 min,用自来水冲去残留的定影液后,室温下晾干。

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