单细胞免疫组库_单细胞免疫组库测序_单细胞TCR/BCR测序-科研实验整体外包服务-技术服务-生物在线
单细胞免疫组库_单细胞免疫组库测序_单细胞TCR/BCR测序

单细胞免疫组库_单细胞免疫组库测序_单细胞TCR/BCR测序

商家询价

产品名称: 单细胞免疫组库_单细胞免疫组库测序_单细胞TCR/BCR测序

英文名称: scRNA TCR-Seq; scRNABCR-Seq

产品编号:

产品价格: 1

产品产地: null

品牌商标: null

更新时间: 2024-01-26T09:44:58

使用范围: null

上海伯豪生物技术有限公司
  • 联系人 : 付先生
  • 地址 : 浦东新区张江高科技园区李冰路151号
  • 邮编 : 201203
  • 所在区域 : 上海
  • 电话 : 177****9967
  • 传真 : 021-51320266
  • 邮箱 : market@shbio.com

免疫组库(Immune Repertoire,IR)是指机体内 T 淋巴细胞和 B 淋巴细胞多样性的总和,反映机体免疫系统在特定时间段内应对外界刺激应答的能力。基于 10X Genomics 的单细胞系统,可实现高通量的单细胞转录组和 V(D)J 测序。不但可以将 TCR/BCR 双链匹配,而且能够同时获得基因表达信息。

 

技术原理

10X Genomic 单细胞免疫组库测序与单细胞 RNA 测序一样,通过微流控系统将带有条形码和引物的凝胶珠与单个细胞包裹在油滴中;接下来在每个油滴内,凝胶珠溶解,细胞裂解释放 mRNA,通过逆转录产生带有 10X barcode 和 UMI 信息的 cDNA。破油(Breaking Emulsions)之后,cDNA 一分为二,后续同时进行基因表达和免疫组库的文库构建。其中 TCR 或者 BCR 的 V(D)J 序列通过设计在 C 区的巢式引物进行 PCR 富集;而 mRNA 的信息,与 10X Genomics 3’mRNA 文库不同,保留的是 5’端的信息。测序后即可一次性获得大量单细胞的基因表达和免疫组库数据。

 

图 5’mRNA 与 TCR/BCR 同时建库

 

技术优势

●通量高

一张芯片具有 8 个独立的通道,可供 8 个样本同时上机,每个通道最高可捕获 10000 个细胞。

● 分辨率高

可获得真正单细胞水平的的免疫组库信息,并且可匹配 TCR/BCR 的双链。

●信息全面

可同时获得单个细胞匹配的 mRNA 和 TCR/BCR 信息。

 

文库结构

● 5’gene expression 文库:

图 10X Genomics 5’gene expression 文库示意图

 

●V(D)J 文库:

图 10X Genomics V(D)J 文库示意图

 

建议测序深度及参数

指标

参数

测序深度 -5’mRNA

50,000~100,000 reads/cell

测序深度 -TCR/BCR

5,000~10,000 reads/cell

测序类型

PE150

 

样本要求

●  类型:

        新鲜组织,原代细胞,细胞系等。

●  来源:

        血液提取、磁珠富集、流式富集、组织解离等。


●  样本量及其它质控要求:

样本类型 要求
细胞悬液 > 10* 目标细胞个数(最少 10,000 个细胞);
  活率 >80%;
浓度 500-1,000 个细胞 /ul;
细胞间无粘连(成团率 <5%);
无大于 40um 的细胞碎片或其他颗粒物;
不存在逆转录抑制剂和非细胞的核酸分子。
血液 EDTA 抗凝的全血(不可肝素抗凝),>5ml。
组织 0.3cm × 0.3cm(不超过 0.5 × 0.5cm)的新鲜组织,4~5 块。


●样本的保存与运输

样本类型 要求
细胞悬液 最好现场制备,如要运输,建议使用伯豪生物自主研发的单细胞保护液,4°C 运输,48 小时内送达伯豪生物实验室。
血液 EDTA 抗凝的全血,4°C 运输,2 小时内送达伯豪生物实验室;或提取 PBMC 后冻存,干冰运输。
组织 建议使用伯豪生物自主研发的单细胞组织保护液,4°C 运输,48 小时内送达伯豪生物实验室。


应用方向

★肿瘤微环境

自身免疫性疾病

感染性疾病

器官、骨髓移植

抗体开发

 

应用案例

1、肝癌免疫微环境

2017 年,北京大学张泽民教授课题组通过大规模单细胞测序技术对肝癌相关 T 淋巴细胞进行了分析,首次在单细胞水平上描绘肝癌微环境中免疫图谱。研究者收集了 6 例肝癌患者的外周血,癌旁正常组织、肝癌组织作为实验样本,然后从各类样本中用流式分选出 CD3+CD8+(cytotoxic T cells,Tc)细胞,以及 CD4+CD25-(Helper T cells,Th)细胞和 CD4+CD25+(regulatory T cells,Tregs)细胞,并进行了单细胞转录组测序和单细胞 TCR 测序,总共获得 5063 个单细胞的数据。其中,单细胞水平分析 TCR 序列发现,在肿瘤侵润的 exhausted T 细胞和 Tregs 细胞中,观察到 TCRs 发生了重复使用。在肿瘤组织中含有相同 TCR 的 T 细胞比例较高,而在外周血和正常组织中比例较低,这说明在肿瘤中的 exhausted T 细胞和 Tregs 细胞发生了克隆扩增。并且相比于早期病人,晚期病人中 T 细胞的克隆扩增更加明显。

图 肝癌中 T 细胞的克隆扩增

 

2、黑色素瘤免疫微环境

2019 年发表在 Cell 上发表的一篇论文,对 25 个黑色素瘤患者肿瘤中总共 46,621 个免疫细胞进行了单细胞 RNA 和 TCR 测序。这些细胞被分成 7 个大群,包括 T 细胞(CD3),NK 细胞(KLRD1),树突细胞(DCs;CD1C),巨噬细胞(C1Q),单核细胞(VCAN),B 细胞(CD19),和浆细胞(immunoglobulins)。初始 T 细胞高表达 IL7R, CCR7 和转录因子 TCF7,特异性表达的基因整体来说比其它类型的细胞少。而非初始 T 细胞具有很高的异质性,其中一小群是记忆 T 细胞,大部分细胞是过渡性 CD8 T 细胞(transitional CD8 effector T),细胞毒性 CD8 T 细胞(cytotoxic CD8 effector T)和丧失功能的 CD8 T 细胞(dysfunctional CD8 T cells),高表达 PD- 1 和 LAG3。这些细胞类群的边界是模糊的,提示转录的梯度表达是造成 T 细胞异质性的原因。CD4 T 细胞主要有高表达 FOXP3 的 Treg,滤泡辅助 T 细胞(CXCL13 表达),以及一小群高表达免疫检查点分子的细胞(dysfunctional CD4 T cells)。分析每名患者的免疫细胞组成,发现大部分 T 细胞类群在患者中都存在,但是病人之间不同细胞类群的丰度有很大差异。丧失功能的 CD8 T 细胞的负荷可能是黑色素瘤最本质的特征。

图 病人间免疫微环境异质性

通过分析 T 细胞的 TCR 序列,发现不同病人的 TCR 克隆型构成差异较大。一些大的克隆中细胞类型也不同,主要表现为丧失功能的 CD8 T 细胞的富集和初始 T 细胞的缺失。患者中丧失功能的 CD8 T 细胞的比例与 T 细胞的扩增程度呈现正相关。通过计算每个细胞的增殖分数,发现丧失功能的 CD8 T 细胞有最高增殖细胞比例,比初始 T 细胞高出 10 倍。

图 黑色素瘤中 T 细胞的克隆扩增

 

3、免疫治疗

靶向 PD-1/PD-L1 通路的免疫检查点抑制剂的出现,给癌症的临床治疗带来了革命性的变化。然而 PD- 1 抗体的抑癌机制,并不完全为人所知。其中一个非常关键的问题是,PD- 1 抗体的抑癌效果,究竟是依赖于在治疗前就存在于肿瘤中的浸润淋巴细胞的再激活,还是治疗之后,肿瘤外的杀伤 T 细胞进入肿瘤?这个问题,目前也是不清楚的。来自斯坦福大学医学院的研究团队,从接受 PD- 1 抗体治疗前后的基底细胞癌(BCC)或鳞状细胞癌(SCC)患者身上采集了 79046 个细胞(包括癌细胞和各种免疫细胞),进行了单细胞 RNA 测序和 TCR 测序。基于单细胞 RNA 测序结果,细胞分成 19 个亚群。

本研究的重点是免疫细胞,尤其是浸润性免疫细胞,以及治疗前后的变化,以了解克隆性 T 细胞对 PD- 1 抗体治疗的反应。因此研究人员把所有的 33106 个肿瘤浸润性 T 细胞做了个更细致的分类,包括表达 CD4 的调节性 T 细胞(Treg)细胞,滤泡辅助性 T(TFH)细胞,T 辅助细胞 17(TH17)细胞;以及表达 CD8 的幼稚细胞,记忆 T 细胞,效应记忆 T 细胞,活化 T 细胞,慢性活化 / 耗竭 T 细胞,中度耗竭 / 活化细胞。进一步分析发现,在 PD- 1 抗体治疗之后,滤泡辅助性 T 细胞,以及活化,耗竭和耗竭 / 活化的 CD8 阳性 T 细胞的频率增加,并且耗竭 T 细胞的克隆水平明显更高。更为让研究人员感到意外的是,对于同一个患者而言,治疗后记忆 T 细胞和效应 T 细胞频繁转换为活化状态,但是治疗前的耗竭 T 细胞却没有变成治疗后的非耗竭表型。这表明,即使在 PD- 1 抗体治疗后,已经耗竭的肿瘤浸润 T 细胞也很难变成活化状态了。

图 治疗前后 T 细胞的状态转换。

此外,研究人员还观察到一个有趣的现象,PD- 1 抗体治疗后才出现的耗竭性 T 细胞表现出了新的 TCR 特异性。为了分析外周血中是否存在新发现的肿瘤浸润性 T 细胞,研究人员给患者的血液样品做了 TCR 测序,发现 35.5% 新肿瘤浸润性 T 细胞可以在 PD- 1 抗体治疗后的外周血中找到,而在治疗前的外周血中只能找到 11.8% 的新肿瘤浸润性 T 细胞,不过治疗前的肿瘤里面却没有新肿瘤浸润性 T 细胞。

图 新发现的肿瘤浸润性 T 细胞在外周血中的比例

总的来说,与“冷”肿瘤相比,“热”肿瘤之所以响应 PD- 1 抗体的治疗,可能是由于“热”肿瘤自身的特性,让它能够不断吸引新 T 细胞进入,而不是重新激活已有的肿瘤浸润性 T 细胞。这项研究让我们对免疫检查点抑制剂的作用机制有了新的认知,这对临床治疗和疗效的检测都有一定的价值和意义。

-END-

电话咨询:021-58955370