ELISA实验步骤武汉博士德生物工程有限公司

技术服务信息

服务名称:ELISA实验步骤
服务类别:免疫学服务 - 病理学服务
价格:询价
允许参观:不允许参观
所在区域:湖北.武汉
更新时间:2010/3/29 11:53:00
浏览人数:13551
诚信指数:469点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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武汉博士德生物工程有限公司
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技术服务详细描述

ELISA实验步骤

工作原理(以VEGF ELISA Kit为例
      血管内皮细胞生长因子(VEGF)是最重要的血管生长因子之一。二个亚单位由二硫键连接,组成分子量46-48KDa的糖蛋白质。VEGF有多个亚型。根据其亚单位所含氨基酸数量的不同,分别命名为VEGF121,VEGF144,VEGF165,VEGF189和VEGF206等。
     博士德所提供的VEGF ELISA Kit是典型的夹心法酶联免疫吸附测定试剂盒(Enzyme Linked-Immuno-Sorbent Assay, ELISA)。预先包被的抗体为单克隆抗体,克隆号26503.11。检测相抗体为多克隆抗体,经生物素(biotin)标记。样品和生物素标记抗体先后加入酶标板孔反应后,PBS或TBS洗涤。随后加入过氧化物酶标记的亲和素反应;经过PBS或TBS的彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的VEGF呈正相关。
推荐您使用ELISA试剂盒
试剂盒中内容(96)
1. 重组人VEGF冻干标准品,10ng/管,总2管。
2. 预包被抗人VEGF抗体的96孔板。
3. 样品稀释液,30ml。
4. 生物素标记抗人VEGF,120μl,效价1:100。
5. 抗体稀释液,12ml。
6. 亲和素-过氧化物酶复合物(ABC),120μl,效价1:100。
7. ABC稀释液,12ml。
8. TMB显色液,10ml。
9. TMB终止液,10ml。
需要而未提供的试剂和器材
1. 标准规格酶标仪。
2. 自动洗板机。
3. 系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,最好用多通道移液器。
4. 干净的试管和Eppendof管。
5. 使用中性PBS或TBS作为洗涤液。0.01M TBS配法为:1000ml H2O中加Tris 1.2g, NaCl 8.5g;
纯乙酸450μl或浓盐酸700μl左右调节pH值(7.2-7.6)。 0.01 M PBS(pH7.2-7.6)配法:1000ml蒸馏水中加氯化钠8.5g, Na2HPO4·12H2O 3.5g, NaH2PO4·2H2O  0.25g。
注意事项
1. 用户在初次使用试剂盒前,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底。
2. 如果不能对标本立即检测,需将标本冷冻保存。应避免反复冻融。
3. 如果可能,避免使用溶血或含脂过高的血浆。标本量大时,将标本离心或过滤。
4. 建议所有标准品、样本都做双份检测。
5. 标本VEGF含量>2000pg/ml时,用样品稀释液按比例进行稀释,并记录稀释倍数。
6. 为避免室温不同所带来的误差,反应都在37℃进行。
洗板方法
手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下用力拍几次;将推荐的PBS或TBS洗涤缓冲液至少0.4ml注入孔内,浸泡1-2分钟。根据需要,重复此过程数次。
自动洗板:如果有自动洗板机,应在熟练使用后再用到正式实验过程中。
试剂的准备和保存
A. 人VEGF标准品的稀释和使用。
试剂盒提供2管标准品,每管10ng,每次使用1管。
1. 配制10,000pg/ml标准品:取1ml样品稀释液加入标准品管内,盖好后静置10分钟以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解。
2. 配制1000pg/ml标准品:取0.1ml 10,000pg/ml的标准品加入有0.9ml样品稀释液的Eppendorf管中,混匀,做上标记。
3. 配制500pg/ml→15.6pg/ml标准品:准备6只Eppendorf管,每管加0.3ml样品稀释液,分别标记上500pg/ml,250pg/ml,125pg/ml,62.5pg/ml,31.3pg/ml,15.6pg/ml。取0.3ml 1000pg/ml的标准品加入标记500pg/ml的管中,混匀后同样取出0.3ml , 加入下一只管中。余同此类推,直到最后一只样品管。
溶解后的标准品应在12小时内使用。
B.生物素标记抗人VEGF抗体工作液。
1. 根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实际配制时应多配制0.1-0.2ml)。
2. 按1μι生物素标记抗人VEGF加抗体稀释液99μι的比例配制工作液。轻轻混匀。
C.亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)工作液的准备:在使用前1小时内准备。
1. 根据每孔需要0.1ml计算总的用量(实配时应多配制0.1-0.2ml)。
2. 按1μι亲和素-过氧化物酶复合物(ABC)加ABC稀释液99μι的比例配制工作液。轻轻混匀。
操作程序
所有试剂用前需在室温平衡。试剂或样品稀释时,切不可忘记混匀。每次检测都应该做标准曲线。如果估计样品VEGF浓度>2000pg/ml时,应在试管中将样品用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围。
1. 确定本次检测所需的已包被抗体的酶标板孔数目,并增加1孔作为TMB空白显色孔。总数=样品数+9;做双份检测时×2。其余重包装好放如冰箱中。
2. 将1000pg/ml ,500pg/ml,250pg/ml,125pg/ml,62.5pg/ml,31.3pg/ml,15.6pg/ml的标准品各0.1ml依次加入一排7孔中,1孔只加样品稀释液的作为零孔。对于人血清、体液、组织匀浆或细胞培养上清,每孔先加50μι样品稀释液,再加50μι样品。
3. 酶标板加上盖,37℃反应120分钟。
4. 反应后用自动洗板机吸去酶标板内的液体(将自动洗板机的洗涤次数设为零再开始即可);或甩去酶标板内液体,再对着吸水纸拍几下。不洗。
5. 将准备好的生物素抗人VEGF抗体工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)。37℃反应60分钟。
6. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤3次,每次浸泡1分钟左右。吸去或甩去多余液体。
7. 将准备好的ABC工作液按每孔0.1ml依次加入(TMB空白显色孔除外)。37℃反应30分钟。
8. 0.01M TBS或0.01M PBS洗涤5次,每次浸泡1-2分钟左右。吸去或甩去多余液体。
9. 按每孔0.1ml依次加入TMB显色液,37℃避光反应20-25分钟(此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度蓝色,后3-4孔差别不明显)。
10. 按每孔0.1ml依次加入TMB终止液,此时蓝色立转黄色。
11. 用酶标仪在450nm测定O.D.值,将TMB空白显色孔设为对照。
12. 所有的标准品和样品的吸光值减去零孔的吸光值后,在坐标纸上画出曲线,以吸光值作为纵坐标,以浓度作为横坐标。
13. 根据样品的吸光值在坐标上找出对应的浓度。用户也可以使用各种应用软件来计算(下载)。应记住由于样品稀释了1倍,其实际浓度应该×2。
操作程序总结:
1. 加样品和标准品,37℃反应120分钟。不洗。
2. 加生物素标记抗体,37℃反应60分钟。0.01M TBS洗涤3次。
3. 加ABC,37℃反应30分钟。0.01M TBS洗涤5次。
4. TMB37℃反应20-25分钟。
5. 加入TMB终止液,读数。

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