原位杂交实验步骤武汉博士德生物工程有限公司

技术服务信息

服务名称:原位杂交实验步骤
服务类别:分子生物学服务 - 分子生物学整体服务
价格:询价
允许参观:不允许参观
所在区域:湖北.武汉
更新时间:2010/3/29 11:53:00
浏览人数:12649
诚信指数:469点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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武汉博士德生物工程有限公司
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湖北·武汉
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技术服务详细描述

原位杂交实验步骤
 
BCL-2是主要的抗凋亡基因。本试剂盒采用针对人、大鼠、小鼠的BCL-2特异性的寡核苷酸探针,经地高辛标记。 由于采用多相寡核苷酸探针和高敏感标记技术,并配合使用敏感性加强型的原位检测方法,具有敏感性特别高,背景清晰,结果准确可靠的优点。可以检测出常规福尔马林固定,石蜡包埋标本的BCL-2 mRNA序列。针对人BCL-2靶基因的mRNA序列为:
(1) 5'--GATGA AGTAC ATCCA TTATA AGCTG TCGCA--3';
(2) 5'--GCGCT CAGCC CGGTG CCACC TGTGG TCCAC--3';
(3) 5'--GGGAG ATGTC GCCCC TGGTG GACAA CATCG--3';
大鼠、小鼠和人的序列仅3bp/90bp不同。兔和人序列基本相同。
 
所需试剂:
推荐您使用本公司BCL-2原位杂交检测试剂盒
试剂盒中内容:
1.胃蛋白酶(×10; Pepsin)2ml;
2. 预杂交液 2ml;
3. BCL-2寡核苷酸探针杂交液 2ml;
4. 封闭液 5ml;
5.生物素化鼠抗地高辛 5ml;
6. SABC-POD 5ml;
7. 生物素化过氧化物酶 5ml。
用户自备试剂:原位杂交专用盖玻片(博士德有售);POLY-L-LYSINE;DEPC;20%甘油
缓冲液(3%柠檬酸,2×SSC,0.5×SSC,0.2×SSC, 原位杂交用 PBS )

一.培养细胞和冰冻切片
准备工作:
固定液:4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6);1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6)
3%柠檬酸--100ml蒸馏水中加柠檬酸(C6H8O7·H2O)3g,PH2.0左右。
2×SSC--1000ml蒸馏水中加氯化钠17.6g,柠檬酸三钠(C6H5O7Na3·2H2O,分子量294)8.8g。
0.5×SSC--300ml蒸馏水加100ml 2×SSC即可。
0.2×SSC--270ml蒸馏水加30ml 2×SSC即可。
20%甘油--20ml甘油加80ml蒸馏水即可。
原位杂交用PBS--0.02M phosphate ;0.5M NaCl(1000ml蒸馏水加氯化钠30g,Na2HPO4·12H2O 6g, NaH2PO4·2H2O 0.4g),PH7.2-7.6。
操作程序:
注意:最重要的是及时固定,并在固定液中加入0.1%的DEPC处理,以抑制RNA酶对mRNA的分解作用。此外,过度固定对原位杂交有明显的不利影响。
1.玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。切片厚度10-20μm。
2.细胞在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养,条件为37℃和5%的CO2,所用培养基为 Dulbecco基础培养基。细胞长好后0.1M PBS(PH7.4)洗2分钟×3次。
3.培养细胞和冰冻切片均可用下述方法固定:固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 20--30分钟。蒸馏水充分洗涤,干燥后-20℃冰冻可保存2周以上。
4.30%H2O2 1份+纯甲醇50份混合,室温处理30分钟。蒸馏水洗涤3次。
5.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化5-120秒钟。有时也可以不消化。原位杂交用 PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
6.后固定:胃蛋白酶消化后才需要。固定液为1%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.2-7.6),含有1/1000 DEPC。室温固定 10分钟。蒸馏水洗涤3次。
7. 预杂交:湿盒的准备--干的杂交盒底部加20%甘油20ml以保持湿度。按每张切片20μι加预杂交液。恒温箱38-42℃2-4小时。吸取多余液体,不洗。
8. 杂交--按每张切片20μι杂交液,加在切片上。将原位杂交专用盖玻片的保护膜揭开后,盖在切片上。恒温箱38-42℃杂交过夜(根据杂交情况可以调节)。
9. 杂交后洗涤:揭掉盖玻片,37℃左右水温的2×SSC洗涤5分钟×2次;37℃0.5×SSC洗涤15分钟×1次; 37℃0.2×SSC洗涤15分钟×1次(如果有非特异性染色,重复0.2×SSC洗涤15分钟×1-2次)。
10.滴加封闭液:37℃30分钟。甩去多余液体,不洗
11.滴加生物素化鼠抗地高辛: 37℃ 60分钟或室温120分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
12.滴加SABC:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×3次。勿用其它缓冲液和蒸馏水洗涤。
13.滴加生物素化过氧化物酶:37℃20分钟或室温30分钟。原位杂交用PBS洗5分钟×4次。
14.DAB显色:使用DAB显色试剂盒-1ml蒸馏水加显色剂A,B,C各一滴,混匀,加至标本上。一般显色20-30分钟。若无背景出现则可继续显色。也可自配DAB显色剂后显色。充分水洗。
15.必要时苏木素复染,充分水洗。
16.酒精脱水,二甲***透明,封片。
二.石蜡切片
如果有条件的话,应尽可能地采用新鲜标本。标本离体后,及时予以固定。固定液为4%多聚甲醛/0.1 M PBS(PH7.0-7.6),含有1/1000 DEPC。标本较大时用刀片切成厚度不超过4mm的小块,固定1小时即可,较大的标本固定不要超过2小时。某些组织对过度固定尤其敏感,如动物大脑,固定时间30-40分钟,一般不要超过1小时。
1. 常规脱水、浸蜡、包埋。切片厚度6-8μm。
2. 玻片的处理:一般采用多聚赖氨酸或APES。
3. 石蜡切片经常规脱蜡至水。30%H2O2 1份+蒸馏水10份混合,室温5-10分钟以灭活内源性酶。蒸馏水洗3次。
4.暴露mRNA核酸片段:切片上滴加3%柠檬酸新鲜稀释的胃蛋白酶(1ml 3% 柠檬酸加2滴浓缩型胃蛋白酶,混匀),37℃或室温消化3--30分钟(视标本新旧、厚薄自行调整)。用户可以比较不同的消化时间,例如5分钟,10分钟,20分钟,30分钟。以找到最佳的消化时间。原位杂交用PBS洗3次×5分钟。蒸馏水洗1次。
其余步骤和冰冻切片6-16步相同。
结果观察:BCL-2 mRNA的细胞胞浆着色呈棕黄色。
注意事项:由于特定的mRNA序列仅占总mRNA的极少数,加上基因仅由四个碱基排列组合而成,因此原位杂交容易出现非特异性染色。通过不加探针和用阴性标本做对照,基本可以确定染色是否为特异性的。有明显的非特异性染色现象时,用预杂交液对含探针的杂交液进行稀释,一般稀释2-10倍;并应加强探针杂交后的洗涤。如果有少量的细胞核着色属于正常情况;如果出现大量的细胞核着色,往往和标本固定时间过长有关,应重新处理标本。


地址:武汉市关山二路特1号国际企业中心3号楼5楼
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