Pulldown和元生物技术(上海)股份有限公司

技术服务信息

服务名称:Pulldown
服务类别:细胞生物学服务 - 其它
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允许参观:协商决定
所在区域:上海.上海
更新时间:2018/3/6 10:48:00
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和元生物技术(上海)股份有限公司
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技术服务详细描述

GST Pull-down实验

摘要:体外利用GST-PES1六种突变体蛋白(1-588aa全长,1-415aa, 322-455aa缺失,322-588aa,220-588aa,101-588aa)与His-NPM1的pull-down实验,确定PES1的220-322aa区域是与NPM1相互作用的结构域。为进一步研究PES1的功能提供实验数据。
关键词:PES1,NPM1,Pull-down, 蛋白相互作用,原核表达

 

一、 实验原理
利用重组技术将PES1蛋白与GST (Glutathione S transferase) 融合表达,融合蛋白通过GST与琼脂糖微球上结合的GTH (Glutathione)亲和结合。因此,如果PES1与NPM1之间有直接相互作用,当结合了PES1蛋白的GTH微球的与含有NPM1蛋白的细胞裂解液混合孵育,再通过离心富集GST微球,得到的样品中可以检测到NPM1。

 

二、 实验目的
在体外检测 NPM1 (nucleophosmin )与PES1(pescadillo)之间的直接相互作用,确定PES1与NPM1相互作用的结构域。

 

三、 实验步骤
1. 6×His-NPM1(pET-28a)质粒转化BL21-DE3感受态细胞:
2. 培养诱导蛋白表达 :
1) 挑取6×His-NPM1单克隆菌落到5ml培养基(含amp抗生素)。
2) 摇床37℃培养12-15h。按照1:100比例接种到50ml的培养基(含amp抗生素)。
3) 37℃培养到OD600吸光光度值0.6-0.8(大概2.5-3h)。
4) 加入100mM IPTG至终浓度1.0mM诱导表达。
5) 低温(30℃)继续诱导培养2-4h。
6) 转移菌液到离心管,7700 g离心10min。弃去上清,在冰上控干。
7) 沉淀重悬在2.5ml PBS中。取10μl留用SDS-PAGE分析。
3. 裂解细胞:
1) 加入25 μl lysozyme(10 mg/ml in ddH2O)。利用干冰或者液氮冻融三次。 适宜条件下超声使菌液变得澄清。
2) 12,000g 4℃离心15min,上清转移到新的离心管。
4. 准备glutathione sepharose 4B beads,结合GST融合蛋白:
1) 将sepharose 4B摇动后使其重悬。
2) 取 500μl sepharose 4B beads,使用10ml PBS彻底清洗3次以去除乙醇。
3) 500g离心5min去除上清。
4) 使用500μl PBS重悬Sepharose 4B beads。
5) 每样品取20μl Sepharose 4B beads, 加入1ml binding buffer,再加入5μg纯化的GST对照蛋白,1-588aa全长GST-PES1
蛋白,1-415aa, 322-455aa缺失,322-588aa,220-588aa,101-588aa。
6) 室温混合孵育1h。
5. Pull-down 实验:
1) 每样品中加入His-NMP1诱导表达裂解液100μl。
2) 4℃混合过夜。
3) 500g离心5分种弃去上清。
4) 使用lysis buffer洗涤3-4 次。
5) 加入2x SDS上样液,煮样品10min。
6. Western Blot分析结果:
使用anti-his标签抗体检测 。

 


四、 实验结果

                                                                        图1. GST-PES1各种突变体示意图

 

                                                                                                                                                                                                


                                                                              图2. GST Pull-down结果

                                                    
从图2的结果可以看到,PES1的220-322aa之间的结构域是与NPM1相互作用必须的。

 

五、 参考文献
1. Zhang J, Yang Y, Wu J. B23 interacts with PES1 and is involved in nucleolar localization of PES1. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2009; 12: 991-997.

 

 

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