有效靶点筛选和元生物技术(上海)股份有限公司

技术服务信息

服务名称:有效靶点筛选
服务类别:细胞生物学服务 - 筛选/发育服务
价格:寻价元
允许参观:协商决定
所在区域:上海.上海
更新时间:2018/3/6 10:48:00
浏览人数:3866
诚信指数:891点
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使用范围:仅限科研使用,不能应用于临床
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和元生物技术(上海)股份有限公司
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姜女士
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上海·上海
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技术服务详细描述

人Oct-4基因干扰慢病毒有效靶点验证实验

摘要:本实验使用qPCR和Western Blot实验验证4个针对人Oct-4基因干扰慢病毒的干扰效果。实验结果表明与阴性对照比较PY1002慢病毒的干扰效率在mRNA和蛋白水平分别达到90%和80%以上。
关键词:RNAi,Oct-4,qPCR,Western Blot

 

一、 实验原理
由于基因转录后的mRNA高级结构的存在以及序列SNP位点,mRNA翻译效率等诸多因素的影响,设计的RNA干扰靶点最终在蛋白水平的干扰效果也不尽相同。使用qPCR以及Western Blot对RNA干扰靶点的效果进行检测可以获得有效的干扰靶点,为后续的基因功能提供实验基础。

二、 实验目的
使用qPCR以及Western Blot对RNA干扰靶点的效果进行检测以获得有效的干扰靶点,为后续的基因功能提供实验基础。

三、 实验步骤
1. 准备细胞:
1) 细胞铺板:
将PANC-1细胞按30%的融合度接种到6孔板:
a) PANC-1细胞配成4×105 cells/ml细胞悬液,待铺板。
b) 每孔铺2×105 cells/well,铺2块6孔板。
2) 感染慢病毒:
12~20h后感染Oct-4干扰慢病毒及对照慢病毒:
a) 根据公式计算病毒用量: (细胞数×MOI值/病毒原液滴度)×103=病毒用量(μl)。
b) 本实验中MOI取50,吸去与加入病毒体积相同培养基。
c) 每孔加2.5μl的polybrene (1mg/ml),使polybrene终浓度达到5μg/ml。
d) 24h后换,弃去培养基后每孔加入1.5ml新鲜的培养基。
e) 48h后收集细胞,一块6孔板抽提RNA,备用。
f) 72h后另一块6孔板制备蛋白样品,备用。 
2. Real-time PCR:
1) 总RNA抽提:
说明:根据Invitrogen公司的Trizol操作说明书进行,均为RNase-free操作。
a) 离心去细胞上清,每孔加入1000µl Trizol,吹打,室温静置5min,后转移至另一新的1.5 ml 离心管中。
b) 每管加入200 µl氯仿,用力震荡15s,室温静置15min。  
c) 4℃,12000 rpm,离心15min。  
d) 从每管中吸取上清至另一新的1.5 ml 离心管。加入等体积异丙醇,混匀后4℃沉淀 10 min。  
e) 4℃,12000 rpm离心10 min后,去上清。
f) 加入至少1 ml 4℃预冷的75%乙醇,洗涤沉淀及离心管壁。
g) 4℃,10000 rpm离心5 min,弃上清。
h) 4℃,10000 rpm再次离心5 min,吸去残液,室温干燥(不需完全干燥)。
i) 加入20 µl RNase-free水,至完全溶解,紫外分析测定所抽提RNA的浓度。
2) RNA逆转录获cDNA:
M-MLV逆转录酶和dNTP购自PROMEGA公司。Oligo dT购自上海生工。RNase -free的物品都购自Axygen。
说明:根据Promega公司的M-MLV操作说明书进行, 均为RNase-free操作。
a) 将1 µl Oligo dT(0.5µg/µl) 和2.0µg Total RNA加入到PCR小管中,补充DEPC-H2O至9μl。混匀后离心,70℃温浴10min。 之后立即插入到0℃冰水浴中,使Oligo dT和模板退火。
b) 按下表的比例,根据反应管数算出所需的试剂量。将M-MLV酶等在冰上混匀,得到RT反应液。
c) 在每个反应管中加入的11μl的RT反应液,混匀后离心。

                                 

d) RT反应在42℃进行1h后完成,之后用70℃处理10min使RT酶失活。
e) 得到的RT反应产物-cDNA可立即用于PCR,也可保存在-80℃以后使用。

3) Real-time PCR检测:
按下列比例配置反应体系 :
                                 
a) 设定程序为两步法Real-Time定量。预变性95℃,15s,之后每一步变性95℃,5s,退火延伸60℃,30s,共进行45个循环。每次在延伸阶段读取吸光值。

                             

Cycle 1: (1X)
Step 1:   95.0 ℃   for 00:15.
Cycle 2: (45X)
Step 1:   95.0 ℃   for 00:05.
Step 2:   60.0 ℃   for 00:30.
Data collection and real-time analysis enabled.


b) 制作熔解曲线。PCR结束后, 在95℃变性1min。然后冷却至55℃,使DNA 双链充分结合。从55℃开始到95℃,每一步增加0.5℃,保持4s,同时读取吸光值。

Cycle 3: (1X)
Step 1:   95.0 ℃   for 01:00.
Cycle 4: (1X)
Step 1:   55.0 ℃   for 01:00.
Cycle 5: (81X)
Step 1:   55.0 ℃-95.0 ℃  for 00:04.
Increase set point temperature after cycle 2 by 0.5 ℃

3. Western Blot:
1) 总蛋白抽提:
a) 从培养箱中取出细胞,弃去细胞培养液,PBS洗涤2次。
b) 弃去PBS,加入适量预冷的2×Lysis Buffer,配方:1M Tris-HCl(pH6.8)100mM,*** 2%,甘油 20%,SDS 4%。
c) 细胞刮刮下细胞,将样品转移入离心管中,冰上裂解细胞10~15 min。
d) 超声破碎仪破碎细胞(200 W共4次,每次5s,间隔2s)。
e) 混匀后,沸水浴煮5-10 min,4℃存放备用。
2)  SDS-PAGE:
a) 制胶:根据目的蛋白分子量大小配制不同浓度的胶,具体体系如下:
                            

b) 上样:等胶凝固好后,拔去梳子,电泳缓冲液清洗上样孔,将准备好的样品上样。
c) 电泳:30mA 2h。
3) 免疫印迹(湿转):
电泳结束后,使用转移电泳装置,在4℃,400 mA恒流条件下电转120min,将蛋白转移到PVDF膜上。
4) 免疫显色:
a)  封闭:用封闭液(含5%脱脂牛奶的TBST溶液)室温封闭PVDF膜1h。
b)  一抗孵育:封闭液稀释抗体,然后与封闭好的PVDF膜室温孵育4℃过夜。
c)  洗膜:TBST洗膜3次,每次10min。
d)  二抗孵育:用封闭液稀释相应的二抗,室温下孵育PVDF膜2h。
e)  洗膜:TBST洗膜3次,每次10min。
f)  采用Amersham公司ECL+prime Western blotting system试剂盒进行显色。
g)  X光显影:在暗房中进行获得显示条带的胶片加ECL、曝光、显影、定影的。
具体步骤如下:
i. 将PVDF膜置于平铺好的保鲜膜上,以1:1的比例混合A液和B液,将混合液均匀滴加在PVDF膜上,避光反应3-5min。
ii. 将膜取出,稍微沥干多余的ECL底物反应液,放入暗盒,铺上保鲜膜(避免产生气泡),放上X光片(避免X光片的移动),关  
上暗盒,曝光1-2min。
iii. 取出X光片,放入显影液中,约1min后取出,在清水中漂洗几秒钟,后放入定影液中至少2min。
iv. 取出X光片,晾干,分析。

 

 

四、 实验结果
表1.定量数值及分析(2-ΔΔCt分析法)
           

                                                             图1. qPCR定量数值及统计分析结果
                                                                            ***表示p<0.001

 

 

 

 

                                                                 图2. Western blot


 从以上数据可以看到,在PANC-1细胞中,四个干扰慢病毒对Oct-4基因均有一定程度的干扰作用,其中PY1002慢病毒的干扰效率在mRNA和蛋白水平分别达到90%和80%以上。

 

五、 参考文献
1. F.M.奥斯伯等著,马学军等译,精编分子生物学实验指南(第四版),科学出版社

 

 

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