南京蓝盾生物科技有限公司

  根据给定GeneID或DNA序列，设计3个敲除位点构建敲除载体，通过测序验证载体是否构建成功。在构建成功的基础上，提取去内毒素质粒并转染细胞，进行敲除效率验证。

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根据给定GeneID或DNA序列，需要插入的DNA序列，以及插入位置。在插入位置位置附近设计3个sgRNA以及donor并构建载体、转染细胞、单克隆的分选。最终通过测序验证是否得到插入的细胞系。

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构建慢病毒Cas9表达体系可以有效的将Cas9转入细胞，并高效表达。为第二步转入识别靶点的gRNA筛选阳性细胞的抗性基因或荧光基因，用于同源重组模板，降低了难度。

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慢病毒可以有效感染分裂期和静止期细胞、长期稳定表达外源基因等优点，适合RNAi研究和体内实验中难于转染的细胞。

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慢病毒是以HIV-1（人类免疫缺陷1型病毒）为基础发展起来的。将目标基因包装到用于过表达的慢病毒中，可以有效感染各种细胞，同时达到稳定遗传的效果。

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