肝细胞负责糖异生、尿素循环、药物代谢等关键代谢，是肝脏的主要功能细胞。肝功能衰竭直接导致代谢性肝病。但目前为止缺乏能够重现代谢功能的原代人肝细胞（PHH）模型。

传统的肝细胞“三明治培养法”无法实现肝细胞的长期扩增，而基于小分子抑制剂的培养法可能引起胆管分化（即“脂肪变性”，高功能性细胞被重编程为具有增殖能力的细胞）。现有的类器官培养技术可从小鼠成体肝细胞和胎儿肝母细胞中获得体外3D自组织模型，拥有与来源组织近似的分子特性与结构组成，但缺乏确保成体PHH长期扩增同时保留生理功能的培养方案。

2025年4月16日，日本庆应义塾大学医学院Toshiro Sato团队在顶刊Nature上发表论文“Generation of human adult hepatocyte organoids with metabolic functions”，首次成功开发了一种能够长期维持人成年肝细胞代谢功能的类器官培养系统，克服了人成年肝细胞在体外培养中面临的长期自我更新与代谢功能的复刻两大难题，在基因编辑和疾病建模中具有强大潜力。

研究团队首先使用癌症基因组图谱 (TCGA) 数据集分析发现，WNT、Ras、TGFβ、STAT3和PKA等信号通路的改变与肝细胞癌的发生密切相关。在此基础上，他们设计了一种包含EGF、HGF、FGF-10、Wnt/R-spondin、TGFβ家族抑制剂（A83-01和Noggin）、IL-6和PKA激活剂（forskolin）的培养基，用于促进肝细胞的长期扩增。

实验结果表明，这种扩增培养基能够高效地形成表达肝细胞标志物（如白蛋白和HNF4α）的小囊状类器官（人肝细胞类器官，HHOs）。获得的HHOs能够在体外长期培养，且在形态上与肝细胞相似，表现出良好的增殖能力。

戒断筛选实验显示，Wnt/R-spondin、EHF、TGFβ抑制剂和IL-6是生长支持因子。Noggin和forskolin则对长期稳定性至关重要。需要注意的是，肝内胆管细胞类器官(ICOs) 生长速度较快，可能与HHOs争夺生态位，因此需要根据形态学进行人工去除。

图1：基于细胞因子的HHOs的扩增

以上培养基可维持HHOs扩增2-3个月，但其增殖速度在1个月左右已经开始减慢。有鉴于IL-6（一种可激活STAT3的细胞因子）可以促进HHOs增殖，研究人员筛选了同类激活因子，发现oncostatin M（OSM）对细胞扩增的作用最强。

OSM可驱动HHO的上皮样基底极性，同时与富含层粘胶蛋白的细胞外基质（Matrigel）相互作用，共同促进HHOs增殖（以指数方式繁殖至少3个月，并在6个月内保持其生长）。此外，OSM还维持了其肝细胞特性，防止了导管化生。

图2：OSM-STAT3促进HHOs的稳定扩增

除OSM外，研究人员接下来发现，YAP信号也通过不同的机制诱导HHO扩增，但这种刺激并非不可或缺。阻断YAP信号对HHO增殖的影响很小。不过，由LATS抑制剂（LATSi）激活的YAP协同增强了HHO与OSM的增殖，导致类器官在3-4周内增殖超过一百万倍。另一方面，YAP和TGFβ靶基因还可能促进导管化生（胆管细胞样特征的出现）。而OSM则能够阻断YAP信号活性、抑制限制肝细胞增殖的TGFβ靶基因的表达，从而促进肝细胞扩张并防止导管化生。

以上结果表明，LATSi与OSM可以协同促进HHOs增殖最大化。

在使用更昔洛韦治疗的肝细胞衰竭的TK-NOG小鼠中，来自于年轻供体（2岁以下）的HHOs比原始PHH显示出更高的定植效率。

如前所述，LATSi处理使HHO在3周内扩增百万倍，但导致再生效率下降，这表明累积增殖阻碍了再生潜力，这可能与扩增过程中端粒缩短有关。

图3：HHOs在小鼠体内的肝脏再生

在扩增培养基的基础上，研究人员进一步优化了分化培养基，通过去除细胞因子OSM、WNT/R-spondin及Noggin、引入激素（生长激素、催乳素和皮质醇）和γ分泌酶抑制剂（DAPT）的混合物，成功诱导HHOs分化为具有代谢功能的成熟肝细胞类器官（dHHOs）。

图4：具有代谢功能的dHHOs的建立

主成分分析（PCA）显示，dHHOs具有与PHH整体转录组的相似性。转录组学分析也显示，dHHOs具有与PHH代谢功能相关的基因表达模式，包括胆汁酸分泌、脂肪酸代谢、胆固醇代谢、药物代谢、糖异生和尿素循环等。

具体而言，与扩增HHO（eHHO）相区别，dHHO 中存在微管系统，可合成胆汁酸、并产生甘油三酯（无论是否补充 Wnt/R-spondin）。在长期扩增（超过90天）中，HHO中的甘油三酯生成能力和脂质积累保持完好，证明其具有肝细胞特异性的脂质代谢。

dHHO还具有重现药物吸收和代谢的能力，可用于药物在肝细胞中的毒性评估。此外，dHHOs还能够进行糖异生和尿素循环，这在体外培养的肝细胞模型中是难以实现的。其甚至具备产生血浆白蛋白的能力（生成率为每百万细胞 50 至 150 μg 天^-1，与人体内的估计生成率每百万细胞 37-105 μg 天^-1相当），也是长期培养的人肝细胞模型的重大突破。

图5：dHHOs的代谢特征

对PHH进行基因工程改造可以增进对肝脏疾病的了解，但此前相关工作一直存在挑战。本文中，研究人员建立了HHO 的基因编辑工作流程，解决了电穿孔效率低、基因工程改造后的生长停滞和导管化生三个难题，改良了电穿孔条件，并加入LATSi和人血小板裂解物以使基因编辑的类器官有效扩增，与此同时并不会出现早期生长停滞。

总而言之，HHOs可以作为一种稳定且可操作的基因编辑平台，用于研究肝脏疾病和开发治疗策略。

图6：基因敲除的HHOs

本研究开发的系统首次实现了人成年肝细胞的体外长期自我更新，并同时保持了其代谢功能，克服了以往培养方法的局限性。

HHOs在基因编辑和疾病建模方面的成功应用也为研究肝脏疾病的分子机制和开发新的治疗策略提供了有力的工具。

参考资料

1. Igarashi, R., Oda, M., Okada, R. et al. Generation of human adult hepatocyte organoids with metabolic functions. Nature (2025).