做细胞凋亡检测，Annexin V是大家最熟悉的工具。最近试了百萤生物提供的 AAT Bioquest品牌Annexin V-XFD594（荧光结构与Alexa Fluor 594完全相同，性价比友好很多），整理了4个最容易翻车的细节，希望对你有用。
坑1：结合缓冲液里忘了加钙
Annexin V结合磷脂酰丝氨酸（PS）必须依赖钙离子。一定要用说明书配方的结合缓冲液（含2.5 mM CaCl₂），千万别用普通PBS代替，也别加EDTA，否则结果全白做。
坑2：贴壁细胞直接上流式
胰酶消化会损伤细胞膜，导致假阳性。贴壁细胞建议直接在盖玻片上培养、染色，用荧光显微镜观察。悬浮细胞（如Jurkat）没有这个问题，直接离心收集即可。
坑3：只染Annexin V，不染PI
晚期凋亡和坏死细胞同样暴露PS。不加死细胞染料，你分不清早期凋亡（Annexin V⁺/PI⁻）和晚期凋亡/坏死（Annexin V⁺/PI⁺）。强烈建议搭配PI或7-AAD。
坑4：反复冻融
每冻融一次，信号就会衰减一些。第一次解冻后分装成小管（每管2-5μL够一次实验），用一管取一管，避免整管反复冻融。
把这四个坑避开了，数据会很漂亮。