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人脐带来源间充质干细胞分离培养分享

作者:内蒙古奥普赛生物科技有限公司 2024-04-15T00:00 (访问量:3941)

1、实验材料

(1)试剂

α-MEM基础培养基、胎牛血清(BS-1102)、NEAA、L-谷氨酰胺、青链霉素、ITS、生理盐水、PBS、EGF、β-FGF等。

(2)耗材

50ml离心管、10ml移液管、1000ul枪头、 200ul枪头、T25培养瓶、眼科手术剪、镊子等。

(3)仪器设备

离心机、超净工作台、细胞计数仪、电子移液器、手动移液器等

(3)细胞来源

    脐带组织

2、实验方法

(1)溶液配置:

α-MEM完全培养基配置: α-MEM基础培养基+10% FBS+1%NEAA+1%L-谷氨酰胺+1% ITS+20 ng/ml EGF+20 ng/ml β-FGF+1%P/S。

(2)样本采集及预处理

取脐带组织置于生理盐水中,清洗血液,直至溶液清澈;

将清洗干净的脐带组织放置于无菌培养皿(100mm)中,用灭菌剪刀剪成2-3cm的小段;

用生理盐水清洗脐带小段,同时用镊子挤压脐带,挤出脐带内部残留血液,直至无血液附着在脐带表面及断口处,将清洗干净后的脐带小段浸泡于含有1%P/S的PBS中备用;

用镊子夹住脐带小段断口边缘,用剪刀沿纵向剪开脐带,可见脐带内部的三根血管,用PBS清洗剖开脐带内部的血迹;

用剪刀压住脐带小段边缘,镊子小心夹紧脐带内部表层的华氏通胶,轻轻撕下条状华氏通胶,将分离出的华氏通胶组织块浸泡于PBS清洗备用。

华氏通胶组织依次经75%乙醇(30s)、PBS(30s)、75%乙醇(30s)、PBS(1min)后,收集于50ml离心管,加入少量基础培养基,用剪刀尽可能剪碎组织,用PBS重复清洗3次。

(3)人脐带间充质干细胞分离培养

将上述剪碎组织清洗后,按照一定比例,加入T75培养瓶中,轻轻摇动平铺组织后,加入20ml α-MEM完全培养基,置于5% CO2、37℃培养箱中培养,显微镜下观察细胞形态。

3、实验结果

(1)细胞形态

经1-2d培养观察无污染后,继续培养,毎3d对脐带组织进行半量换液,在培养10d是,镜下观察有细胞迁移出,呈短梭形、纤维样(见图1)。

         

图1:人脐带间充质干细胞分离10d形态,100x

持续培养15d后,人脐带间充质干细胞基本铺满T75瓶,可进行传代培养(见图2)。

             

图2:人脐带间充质干细胞分离15d形态,100x

4、实验结论

拟采用本公司的胎牛血清(BS-1102)可在15d从人脐带组织中分离获得原代人脐带间充质干细胞。

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