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春-软骨组织切片 1夏-骨头组织切片2秋-脂肪组织切片冬-组织切片3 春暖花开、桃红柳绿、叠翠流金、冰魂雪魄，缤纷的四季，就这样展现在我们眼前。这些组织和细胞的形、色、光，宛如生命的画笔，在显微镜下绽放着它们的精彩。科学与艺术的邂逅，让我们不得不感叹生命的纯粹和神奇。 好的组织切片，对后续的染色、检测至关重要。今天，小拓就教大家如何进行组织石蜡切片。 动物处死后，立即从动物体取下所需器官，防止组织细胞自溶变性。用生理盐水将血水清洗后，将组织立即浸入4%多聚甲醛中固定，固定时间＞24h。目的是使组织蛋白迅速凝固，使细胞内的结构和成分不再发生变化，保持组织细胞与活体相似的形态结构，固定后的组织块变硬，便于进一步处理。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。 固定后组织块内含有大量的水分要彻底脱去，以便石蜡浸入。将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75%酒精4h-85%酒精2h-90%酒精2h-95%酒精1h-无水乙醇I 30min-无水乙醇II 30min-醇苯5-10min-二甲苯I 5-10min-二甲苯II 5-10min-65°融化石蜡I 1h-65°融化石蜡II 1h-65°融化石蜡III 1h。 将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入模具框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于-20℃冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从模具框中取出并修整蜡块。 将修整好的蜡块置于石蜡切片机切片，厚5~8μm，连续操作可形成蜡带。用镊子和毛笔轻轻取下，放于摊片机45℃ 温水上，使褶皱自然舒展开。载玻片将组织捞起。使其贴片，放置于烤片机（约60℃）烤片。水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。视频教学：javascript:void(0);/*1579164396021*/拓普生物动物共享实验室，拓普生物动物科研服务1.2.3图片来自网络...
文章信息期刊：Advanced Functional Materials影响因子(IF)：15.621文章名称：Enhancing Triple Negative Breast Cancer Immunotherapy by ICG-Templated Self-Assembly of Paclitaxel Nanoparticles(点击获取全文)作者：冯兵作者单位：中国科学院大学&中科院上海药物研究所引用抗体：anti-Calprotectin(CRT)｜bs-2696R anti-high mobility group B1 (HMGB-1)｜bs-0664R文章摘要肿瘤联合免疫治疗在诱导抗肿瘤免疫和调节免疫抑制性肿瘤微环境(ITM)方面均显示出良好的潜力。然而免疫联合疗法的化学物理性质不同，药代动力学特征不一致。吲哚菁绿(ICG)模板自组装置——一种用于制备双药合一的纳米药物，实现了免疫调节剂的肿瘤特异性共传递。通过ICG模板的紫杉醇(PTX)纳米颗粒自组装(ISPN)，以及ISPN在三阴性乳腺癌(TNBC)联合免疫治疗中的应用进行了论证。ISPN通过增强肿瘤的通透性和滞留效应，对ICG和PTX的肿瘤特异性共递送表现出满意的胶体稳定性和高效性。激光照射后，ISPN的ICG组分通过光动力疗法激活抗肿瘤免疫反应，高效诱导肿瘤细胞免疫原性死亡。同时，ISPN抑制调节性T淋巴细胞(Tregs)对抗ITM，释放PTX。ISPN与免疫检查点阻断治疗(αPD-L1)结合使用治疗TNBC，显示出协同的肿瘤退缩、转移抑制和预防复发作用。总的来说ICG模板的纳米药物在开发纳米药物平台和联合免疫疗法应用方面具有巨大潜力。 研究背景三阴性乳腺癌(TNBC)是最具高浸润性和转移性的恶性肿瘤之一。化学疗法是AD临床治疗晚期或转移性TNBC肿瘤的主要方法。然而，由于固有或获得的多重耐药性的发生，化学疗法疗效低下的局限性凸显。前几年免疫治疗，特别是免疫检查点阻断治疗(ICB)开启了癌症治疗的新篇章。尽管前景看好，但由于TNBC肿瘤的免疫原性低和免疫抑制性肿瘤微环境(ITM)，TNBC患者很少受益于当前的ICB治疗。因此，在改善TNBC免疫治疗方面，找到能增强免疫原性并逆转ITM的互补方法仍然是一个巨大的挑战。ICB疗法与化学疗法、光动力疗法(PDT)或放射疗法相结合，具有协同抗肿瘤作用，可促进肿瘤内细胞毒性T淋巴细胞(CTLs)的浸润并克服ITM。然而，联合免疫疗法使用不同的免疫调节剂，其化学物理特性和药代动力学特征不同。尽管基于纳米颗粒的药物递送系统有望实现联合免疫疗法，但目前的纳米药物的制备方案通常过于复杂，无法实现可重复性和质量控制。此外，辅料对于制备载药纳米颗粒是必不可少的，辅料的使用会导致载药量降低。近年来，无辅料的纳米药物在高效药物输送方面引起了广泛关注。当前大多数无辅料的纳米药物已被设计为可自行组装成纳米制剂的前药结构。小分子疗法的化学修饰对于开发常规的无辅料纳米粒子至关重要，但这可能会削弱抗癌药的治疗性能。鉴于此，作者利用吲哚菁绿(ICG)为模板进行自组装制备二药合一的纳米药物并用于联合免疫疗法。该策略可不使用任何辅料而实现几乎100％的各种小分子药物的负载(图1a)。为了进行概念验证，作者专注于开发用于TNBC联合免疫治疗ICG模板自组装紫杉醇(PTX)纳米颗粒(ISPN)(图1b)。ICG可以进行光动力学疗法(PDT)诱导肿瘤细胞的免疫原性细胞死亡(ICD)。ICD的肿瘤细胞将钙网蛋白(CRT)暴露在细胞膜表面，释放高迁移率族蛋白B1(HMGB1)，并分泌三磷酸腺苷(ATP)启动抗肿瘤免疫应答。同时，与ISPN共传递的PTX通过特异性杀伤调节性T细胞(Tregs)来对抗ITM。PTX是临床治疗TNBC的一线化疗药物之一，它可以稳定化微管蛋白并抑制肿瘤细胞有丝分裂抑制肿瘤生长。相较于PTX的化学细胞毒性，一些临床前和临床研究表明PTX通过调节免疫抑制肿瘤微环境增强了ICB治疗的疗效。例如，低剂量的PTX(5mg/kg)通过下调Tregs有效地逆转了ITM。PTX降低Tregs瘤内浸润，并使细胞死亡受体Fas(又称CD95)上调以此来抑制Tregs的免疫抑制功能。ISPN与免疫检查点阻断剂(即抗PD-L1抗体，αPD-L1)结合使用，在具有TNBC肿瘤免疫能力的荷瘤小鼠模型中显示出协同的抗肿瘤性能(图1c)。综上所述，ICG模板自组装纳米医学可能是TNBC免疫治疗的有力策略。图1.用于TNBC肿瘤免疫治疗的PTX纳米颗粒ICG模板自组装的示意图。(a)可供ICG模板化自组装的小分子药物库；(b)PTX纳米颗粒的ICG模板自组装；(c)ISPN介导的癌症免疫治疗示意图。ISPN联合免疫治疗联合ICB诱导肿瘤细胞ICD，并消除免疫抑制Tregs。研究结果之一ISPN的ICD诱导作用CRT是ICD的主要生物标志物，充当“吃我”信号，以诱导抗原呈递细胞吞噬垂死的肿瘤细胞。由细胞内ROS产生引起的内质网应激可触发CRT表达并将其转运到肿瘤细胞表面。为了研究ISPN在体外的ICD诱导特性，4T1肿瘤细胞在含1ug/ml ICG 的ISPN中孵育8h后，808nm激光照射30s。2小时后CLSM及FC检测细胞表面ICR表达。ICG+L及ISPN均可诱导4TI细胞表面CRT的上调表达(图2a)，而FCM检测结果显示ISPN + L显著引起4T1细胞表面CRT表达。ISPN+L组CRT表达是ICG+L组的2倍(图2b，c)，这可能归因于ISPN + L大量产生细胞ROS。接下来，作者通过检测治疗诱导的蛋白HMGB1的转运。HMGB1通常分布在细胞核，在ICD的肿瘤细胞迁移到细胞外。胞外HMGB1可作为Toll样蛋白受体激动剂促进DC成熟。CLSM结果显示HMGB1全部转运至细胞外(图2d)。FCM结果进一步表明ISPN处理的4T1细胞中HMGB1下降，而激光照射后的4T1细胞中HMGB1进一步降低(图2e)。为了证实ISPN的ICD诱导性能，ATP化验检测ATP分泌。ATP检测结果显示ISPN+L组分别是ICG+L和ISPN组的2.6倍和2.1倍(图2f)。ISPN表明ISPN能有效地诱导肿瘤细胞的ICD。紧接着作者体外检测ISPN诱导肿瘤细胞免疫原性对DC成熟的影响，以此评价ISPN诱导肿瘤细胞的免疫原性。FCM检测显示ISPN+L显著提高DC成熟(图2g)。ISPN组的DC成熟频率约为18.6%，而进行了激光放射处理的肿瘤细胞中提高到了50.1%左右(图2h)。这些结果表明ISPN可有效诱导肿瘤细胞ICD并增强了肿瘤免疫原性以促进DC成熟。体外检测4T1细胞的ISPN细胞毒性，基于ICG的PDT治疗和PTX的化学治疗可引起部分的肿瘤细胞死亡。相比之下，ISPN和激光放射治疗联合可大大降低细胞的存活能力。ISPN介导的化学疗法和PDT在体外具有累积的抗肿瘤作用。图2.体外ISPN的ICD诱导作用。(a)CLSM和(b)FCM检测在ISPN处理及激光放射后4T1肿瘤细胞表面CRT分布；(c)FCM检测4T1细胞表面CRT表达；(d)CLSM和(e)FCM检测ISPN处理的41T细胞中HMGB1的释放；(f)ISPN处理的4T1细胞ATP分泌；(g)ISPN处理的4T1细胞诱导BMDC成熟的FCM图(设门CD11c+)；(h)FCM检测BMDC成熟率；(i)4T1细胞体外细胞毒性试验(标尺=50μm，*p结论在本研究中，作者证明了小分子药物的ICG模板自组装纳米颗粒的制备。相较于游离ICG和PTX，整合ICG和PTX的ISPN在荷瘤小鼠的体外血液循环拉长，肿瘤积累提高。在肿瘤细胞的体外和体内检测，ISPN通过PDT诱导的ICD有效地诱导抗肿瘤免疫并促进CTLs的瘤内浸润。同时，ISPN极大地抑制了Tregs的招募，从而解除ITM。综上所述，通过制备ICG模板的小分子药物自组装纳米颗粒，结合ICB治疗显示出累积的抗肿瘤性能，可抑制肿瘤生长并抑制肺转移，同时能防止肿瘤复发。最重要的是ICG模板自组装容易扩展到其他小分子药物。本研究展示了ICG模板自组装策略在开发无辅料纳米药物和联合免疫疗法方面的潜力。（感谢《Advanced Functional Materials》提供素材！侵删！）Bioss相关抗体推荐 ...
众所周知，正常情况下人体的内分泌系统中各种激素相互协调，共同维持体内平衡，但由于某种原因打破这种平衡时，则会引发异常的激素变化。相比于男性而言，女性的身体对体内激素变化更为敏感，严重时易出现月经不调，进而影响排卵周期（通常涉及卵母细胞的成熟），甚至可导致女性不孕。因此，了解激素如何影响卵母细胞的成熟是女性不孕研究中必不可少的一步。2019年12月16日，中国农业大学夏国良教授和王超副教授研究团队在Nature Communications（IF：11.878）上发表了名为“HDAC3 maintains oocyte meiosis arrest by repressing amphiregulin expression before the LH surge”的研究论文，本研究发现在LH（促黄体生成素）峰形成前，HDAC3（组蛋白去乙酰化酶）通过H3K14去乙酰化来抑制AREG（双调蛋白）表达，从而负调控卵母细胞成熟。通过使用HDAC3抑制剂，可以改善小鼠卵母细胞的成熟和发育能力，进而推测HDAC3可能是提高体外成熟卵母细胞发育能力的潜在靶点，这为进一步解析女性不孕相关研究提供了新的见解，安诺基因在本研究中有幸承担scRNA-seq和RNA-seq相关工作。研究思路主要研究结果1. HDAC3负调控卵母细胞成熟本研究分析了在促性腺激素诱导的小鼠卵泡生长过程中所有I类HDACs的表达模式，发现HDAC3是GCs（颗粒细胞）中仅有的在体内外均被FSH（促卵泡激素）上调且被LH下调的HDAC，这表明其在卵母细胞成熟过程中对促性腺激素诱导的反应中起关键作用。通过小鼠模型实验证明在LH峰形成前，Hdac3的删除会导致卵母细胞提前成熟。结合增殖细胞核染色实验发现卵巢GCs中HDAC3的耗竭可能终止卵巢GC增殖，这与LH对卵母细胞成熟和GC增殖的影响相似。图1 HDAC3负调控卵母细胞成熟2. LH峰形成前HDAC3抑制GCs中AREG的表达通过体内诱导实验（孕马血清促性腺激素，PMSG）、体外抑制剂实验（HDAC1/3抑制剂HDACi 4b和EGFR抑制剂）和ChIP分析发现，HDAC3可在LH峰形成前特异性结合Areg启动子区域，负调控AREG表达，而且HDAC3的缺乏可调节cGMP（细胞周期蛋白GMP）水平来诱导卵母细胞成熟。利用HX-M199和M199培养基培养卵母细胞，发现HDACi 4b对卵母细胞减数分裂成熟无直接影响。选取有/无HDACi 4b抑制剂培养的成熟卵母细胞进行scRNA-seq，结果显示HDACi 4b不影响卵母细胞的发育能力。结合小鼠模型实验中的Hdac3flox/flox和Hdac3cKO卵巢的RNA-seq数据，进一步挖掘受HDAC3调节的其他与卵母细胞成熟相关的因素。图2 HDAC3抑制GCs中AREG的表达3. H3K14ac介导HDAC3和LH作用于Areg表达通过体内体外LH/hCG（人体绒毛膜促性腺激素）诱导实验和ChIP分析，发现H3K14ac可介导LH / hCG作用于靶基因表达。HDAC3敲除实验和HDACi 4b抑制剂实验结果表明，H3K14ac是LH和HDAC3调控AREG表达的关键。同时这些实验证实在LH诱导前，HDAC3可降低体内体外H3K14ac水平。图3 H3K14ac介导HDAC3和LH作用于Areg表达4. FOXO1可将HDAC3募集到Areg启动子区通过Co-IP-MS实验鉴定出结合HDAC3抑制Areg表达的因子，其分别为NCoR复合体的核心成员NCoR1、NCoR2和TBL1X。DNA pulldown联用MS分析和JASPAR数据库注释，鉴定出四个候选转录因子，即SP1、FOXO1、GATA4和Myod1。对它们进行HDAC3 Co-IP实验，结果发现它们可能与HDAC3-NCoR复合体相互作用，而不是直接与HDAC3相互作用。通过交联Co-IP-MS和Western Blotting实验证明FOXO1、GATA4和Myod1可能在Areg启动子处与HDAC3复合物相互作用。交联逆转Co-IP-MS和Western Blotting实验证明FOXO1与HDAC3之间的相互作用。综上，在LH峰形成前，HDAC3可能被FOXO1、GATA4和Myod1中的一个或多个转录因子募集到Areg启动子区。图4 FOXO1可将HDAC3募集到Areg启动子区5. HDAC3和LH通过调节SP1募集到Areg启动子而影响Areg表达已知组蛋白乙酰化是通过使染色质展开和增加转录因子的进入来诱导基因表达，因此，需要鉴定去除HDAC3后与Areg启动子结合的转录因子。通过HDAC3抑制实验、Hdac3敲除实验和ChIP分析，发现SP1参与了HDAC3下调后的Areg转录，同时HDAC3的丢失和H3K14的乙酰化促进了SP1与Areg启动子的结合。SP1抑制实验（SP1抑制剂光辉霉素A）、Western Blotting和ChIP分析结果表明LH诱导H3K14ac并加速SP1进入Areg启动子区。 图5 HDAC3和LH通过调节SP1募集到Areg启动子而影响Areg表达 6. HDAC3抑制剂改善了小鼠卵母细胞的成熟和发育能力根据上述实验，本研究证实了通过抑制GC来源的HDAC3可诱导不依赖于LH的卵母细胞成熟。利用HDACi 4b进行小鼠卵母细胞体外培养，证明其促进了卵母细胞GV阶段向MII阶段的转变。结合体外受精和胚胎移植实验发现HDACi 4b组可以正常受孕，其产生的幼崽数量与体重和对照组相似。同时发现HDAC3是提高不依赖LH的体外成熟卵母细胞发育能力的潜在靶点。图6 HDAC3抑制剂改善了小鼠卵母细胞的成熟和发育能力文章小结本研究通过RNA-seq、scRNA-seq和生理生化实验解析了调控卵母细胞成熟的分子机制，并发现HDAC3可能是提高体外成熟卵母细胞发育能力的潜在靶点，这有助于医生对女性不孕相关疾病进行精准诊断和精准治疗。图7 安诺单细胞测序技术总览作为国内单细胞测序技术整体解决方案的提供商，目前安诺基因单细胞多组学研究具有全面的产品，覆盖三大组学（基因组、转录组、表观组），拥有丰富的项目经验、合作单位100+、物种经验50+、多篇高分文章IF累计100+，能够有针对性并准确服务于不同的研究领域及研究策略，使得科研工作者可以更深入地了解细胞间的异质性。 参考文献：Wang, H., Cai, H., Wang, X. et al. HDAC3 maintains oocyte meiosis arrest by repressing amphiregulin expression before the LH surge[J]. Nat. Commun., 2019,10: 5719. doi:10.1038/s41467-019-13671-8...
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