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2019年10月7日，来自同济大学生命科学与技术学院的杨鹏、高绍荣和王译萱研究团队于Cell Research（IF=17.848）上在线发表题为Precise temporal regulation of Dux is important for embryo development的文章，揭示了Dux的精准调控是早期胚胎发育的关键但非必要条件，并利用三代Sequel II测序证实了Dux-KO小鼠中的大片段缺失。这也是国内首篇使用Sequel II测序数据发表的文章，安诺基因在本次研究中承担了三代重测序的工作。样本选择：Dux-KO小鼠的肝脏和肌肉组织 测序策略：PacBio Sequel II测序，构建30 kb CLR文库 实验设计 主要结果1. 合子基因激活（ZGA）是通过母本向合子转换这一过程实现的，该过程中母本的RNA和蛋白质发生降解，合子基因被转录激活。近期有研究发现Dux是调控ZGA过程的主要诱导因子，它与ZGA转录本结合并快速将其激活，触发胚胎细胞的发育进程。为验证Dux在ZGA及胚胎发育中的重要作用，研究人员利用CRISPR/Cas9技术构建了Dux-KO小鼠模型。将Cas9核酸酶mRNA和两个针对Dux的sgRNA注入受精卵并转移到假孕受体中，之后获得基因经过编辑的F0代。令F0与具有相同遗传背景的野生型（WT）进行回交，获得F1后再次与WT回交，从而获得具有相同突变的杂合Dux+/-（Dux-Het）小鼠，纯合Dux-KO小鼠通过杂合小鼠间的自交产生。 2. Dux-KO和WT小鼠的Dux基因簇分布利用三代重测序技术对Dux-KO小鼠的基因型进行进一步确认，发现了LOC100504180（Duxf1）、Dux（Duxf3）和Gm4981（Duxf4）的大片段缺失，以及Gm10807（Duxf2）、Gm9919（Duxf5）的短片段缺失，体现了PacBio长读长测序在检测大片段结构变异方面的优势。Dux-KO小鼠可以存活到成年，但其频率与孟德尔分布略有偏离（下图左)。Dux-KO小鼠交配所产生的后代相比WT或Dux-Het的后代更少。因此，Dux缺失虽然不致死，但会导致产仔数量的显著减少，表明Dux是早期胚胎发育的关键但非必要因素。Dux缺失导致产仔数量的显著减少 3. 为进一步验证Dux缺失在胚胎中的影响，研究人员采集了Dux-KO和WT个体在多个时期的胚胎，包含受精卵和早中晚期的2C（二细胞）胚胎，进行单细胞转录组（Smart-seq2）分析。Dux仅在早期2C阶段短暂表达，通过对比Dux-KO和WT胚胎在2C阶段各个时期ZGA相关基因的表达，发现在Dux缺失的条件下ZGA过程仍然可以被激活，但发生的时机被推迟（下图d-e）。 WT与Dux-KO胚胎在2C阶段基因表达情况比较 MERVL通常在受精卵阶段就能被检测到，早于Dux的表达，它可以与一些2C基因生成嵌合转录本，促进附近的2C基因表达。在Dux-KO胚胎中发现MERVL在2C阶段的中晚期显著上调（上图f），这与ZGA关联基因的激活显著相关，表明Dux是通过增强而不是直接激活来调控ZGA转录本的表达。4. 在胚胎的2C晚期阶段通常已经检测不到Dux的表达，研究人员为深入探究Dux在早期胚胎发育中的功能，将Dux-EGFP（Dux-OE组）与对照组EGFP的mRNA注射到2C期胚胎的卵裂球中，利用免疫染色法观察胚胎的发育进程。对照组的表达一直持续到囊胚阶段，而Dux-EGFP的表达在8 h后剧烈减弱，且胚胎发育停止在4C阶段。这些结果表明Dux在胚胎中的延长表达会导致早期胚胎的发育受阻。Dux在胚胎中的延长表达导致早期胚胎的发育受阻5. 无论内源还是外源的Dux表达均在胚胎中仅持续了数个小时，尤其当Dux mRNA被注射到受精卵中后，Dux-EGFP在3-5h内剧烈降解，且对胚胎发育未产生影响（下图a-c）。这也进一步表明了Dux的降解对胚胎发育的重要影响。蛋白酶抑制剂MG132的使用大大延迟了受精卵中Dux-EGFP信号的衰减，使得发育受阻（下图d）。此外，Dux-EGFP在NIH3T3细胞系中的过表达也揭示了Dux不仅与ZGA相关蛋白相互作用，也和泛素途径相关蛋白发生相互作用（下图e）。外源Dux-EGFP在受精卵中剧烈降解 综上，本项研究表明了Dux通过增强而不是直接激活ZGA来调控早期胚胎的发育过程。尽管Dux敲除小鼠可以存活至成年，但Dux的缺失会推迟ZGA过程并降低胚胎发育的潜能。此外，Dux在2C阶段早期短暂表达后，会在DNA水平被沉默并在RNA与蛋白水平被降解，长期激活会严重损害早期胚胎的发育。PacBio长读长测序在检测结构变异（SV）方面具有无可比拟的优势，弥补了此前基于二代测序只能集中于分析SNP、InDel等小片段变异的不足，能够更精准地识别大于50 bp的染色体插入、缺失、倒位、易位等，即使是重复区域也能轻松跨越，从而简化分析，使检测分析更准确高效。 自2017年推出三代测序服务以来，安诺优达先后引进了10台PacBio Sequel和4台Sequel II测序仪，产品服务类型涵盖三代基因组组装、人重测序、动植物重测序、全长转录组测序等，累计完成三代项目超800+。2019年7月，安诺优达测序实验室又荣获PacBio官方认证测序服务商证书。安诺优达将秉承客户至上的服务理念为合作伙伴提供更快速、更优质的三代测序服务。...
题目：WDR45 contributes to neurodegeneration through regulation of ER homeostasis and neuronal death期刊：Autophagy影响因子：11.05主要技术： CRISPAR-Cas9、WB、IHC、TMT蛋白组学 、PRM蛋白靶向验证研究背景宏自噬是降解受损细胞器和蛋白质聚集体的主要细胞分解代谢过程。在人类中，在自噬的多个步骤中起作用的各种基因的突变可引起广泛的神经退行性疾病。小鼠WDR45神经元特异性敲除可导致自噬和轴突变性功能障碍，运动协调性差和学习记忆障碍。因此，WDR45的主要功能是调节自噬体的形成，其功能的丧失会导致小鼠行为异常。但WDR45的丧失如何导致BPAN中的神经变性的机制仍不清楚。为了解决这些问题，本文作者构建了WDR45敲除小鼠来模拟BPAN病变的复杂过程，并且利用TMT定量蛋白质组学技术和一系列细胞水平的验证实验来阐明BPAN样病理变化的分子机制。技术路线实验结果1.WDR45基因敲除小鼠显示认知障碍首先作者利用CRISPAR-Cas9技术成功构建了WDR45基因敲除小鼠。图1-1 成功构建WDR45基因敲除小鼠接下来作者利用6月龄野生型小鼠和WDR45基因敲除小鼠进行了一系列的行为学实验，包括morris水迷宫实验、8臂迷宫试验、条件性恐惧实验、旋转实验、三箱社交实验、Pilocarpine诱发癫痫实验等。结果表明实验月龄的WDR45 敲除小鼠在运动协调方面没有明显损害的迹象，但是在空间学习和条件记忆方面存在认知障碍。另外，与野生型小鼠相比，KO小鼠表现出明显地更短的潜伏期和更严重的癫痫发作。图1 行为学实验，显示WDR45基因敲除小鼠具有认知障碍2.WDR45基因敲除小鼠脑内出现神经元丢失由于BPAN患者成年后表现为神经变性病和帕金森病，因此作者利用免疫组化（IHC）和TUNEL染色等方法检查了老年小鼠是否有神经变性的迹象。结果表明：WDR45敲除小鼠在老年时在前额叶皮质和黑质中表现出神经元丢失。图2 WDR45敲除小鼠在老年时在前额叶皮质和黑质中表现出神经元丢失3.脑组织定量蛋白质组学分析揭示了内质网（ER）蛋白在基因敲除小鼠脑中的积累 作者设计了3个10标TMT定量蛋白组学实验，分别研究了5对野生型（WT）小鼠和敲除（KO)小鼠的大脑前额叶皮层（PFC）、海马（HIP）和中脑（MIB）组织的差异定量蛋白组学。共定量到近4000个蛋白，以FC>1.5，P图3 WT和KO小鼠脑组织蛋白质组定量分析另外，生信分析结果表明，内质网（ER）蛋白在基因敲除小鼠脑中积累最为显著，其次是脂质代谢过程和内膜系统组织。图4 生物信息学分析显示内质网（ER）蛋白在WDR45 KO小鼠体内积累4.WDR45通过蛋白酶体和溶酶体途径调节靶ER蛋白接下来，作者研究WDR45如何调节内质网蛋白的水平。首先，Western blot 实验结果证实WDR45 KO小鼠中脑内源性SEC22B显著上调，与质谱定量结果趋势一致。然后，作者在存在或缺乏BAFA1（一种阻止自噬体溶酶体融合的自噬抑制剂）或MG132（一种蛋白酶体抑制剂）的情况下共表达WDR45和4个内质网蛋白，结果表明，BAFA1可有效地阻断WDR45介导的SEC22B降解，而BAFA1和 MG132均可阻断WDR45介导的BCAP31降解。而对照组，只有MG132对GFP的稳定性有轻微影响。这些不同的作用结果表明，位于内质网不同部位的蛋白质被不同的机制降解。此外，在细胞中通过shRNA敲低WDR45，与敲低Scrbl 相比，所有四种ER蛋白质在sh-WDR45的细胞都有积累，与KO小鼠脑中观察到的效果类似。这些结果表明WDR45对内质网蛋白亚群的稳定性有负面影响。图5 WDR45介导靶标内质网（ER）蛋白的降解5.WDR45缺失细胞可导致ER扩增，增加ER应激随后，作者研究了ER蛋白的积累是否与ER面积的扩大相关。通过标记内源性ER蛋白CALR（calreticulin），shRNA敲低WDR45与与敲低sh-SCRBL的细胞相比，显示出明显的内质网扩张。此外，使用衣霉素诱导内质网应激可导致外源WDR45被聚集到WT的ER中，而在WDR45缺失细胞没有这种现象。免疫荧光分析结果表明，在内质网应激后，在WT皮质神经元的溶酶体（红色）中积累了CALR蛋白（绿色），表明内质网蛋白的溶酶体降解需要WDR45。为了验证内质网自噬的这种作用是否是细胞器特异性，作者用羰基*化物间氯苯腙（CCCP）处理细胞来破坏线粒体膜电位。对照组细胞经CCCP处理24小时后，PRKN染色明显减少，线粒体明显萎缩，提示PRKN介导了细胞的有丝分裂。然而，在敲低表达sh-WDR45的细胞中，线粒体明显增大。最后，对小鼠黑质的透射电镜分析显示KO小鼠内质网小管增大。因此，作者证明了宏自噬的缺陷导致了内质网和线粒体这两个独立细胞器的自噬缺陷。此外，作者发现，诱导内质网应激可进一步促进ER伴侣蛋白HSPA5的表达。在KO小鼠的原代神经元中，作者还发现HSPA5表达增加，ERN1/IRE1激活，XBP1选择性剪接增加。 图6 WDR 45缺失细胞表现为ER应激增加，ER面积增加6.WDR 45缺失导致ER应激后细胞死亡增加接下来的实验结果表明，在WDR45缺失的原代神经元中，ER标记的Calr水平升高，自噬受体SQSTM1积累，LC3-II:LC3-I比率降低。作者利用western blot和免疫组化的方法对小鼠脑中以SQSTM1积累为特征的自噬缺陷和LC3-II：LC3-I水平降低，以HSPA5，DDIT3 / CHOP为特征的ER应激增加以及ERN1 / IRE1途径的激活，以及最终增加的细胞凋亡进行了重新描述。内质网应激诱导的细胞凋亡以CASP12的断裂为特征，在16个月龄时，作者还发现WDR45 KO小鼠PFC区CASP12的断裂增加。但在脑组织中UPR通路的激活存在差异。KO小鼠EIF2A磷酸化增加，提示EIF2AK3活化，ERN1/IRE1磷酸化和ATF6（N末端）水平变化不显著。在1月龄的KO小鼠中没有观察到内质网应激、未折叠蛋白反应和凋亡的缺陷，这与衰老是神经退行性变的一个重要危险因素的观点一致。 图7 WDR 45缺失导致ER应激后细胞死亡增加7.激活自噬或抑制内质网应激挽救细胞凋亡作者进一步猜想是否可以通过调节自噬和内质网应激水平来实现对细胞凋亡的药理挽救。作者使用雷帕霉素（mtor信号抑制剂）实验发现，雷帕霉素诱导自噬可能有助于预防或减轻神经退行性疾病的致病性蛋白聚集。此外，作者还使用了牛磺去氧胆酸（一种内质网应激抑制剂）进行实验。结果表明，雷帕霉素或牛磺去氧胆酸可减少WDR45缺失细胞中外源表达的ER蛋白SEC22B和SEC61B的积累。加重内质网雷帕霉素或牛磺去氧胆酸可减轻WDR45缺陷细胞的应激。同时雷帕霉素或牛磺去氧胆酸也降低了WDR45缺失细胞CASP3断裂的增加。流式细胞术标记细胞表面标志物ANXA5/ANNEXIN V和7-ADD的结果表明，雷帕霉素和牛磺去氧胆酸均可减轻tm诱导的细胞凋亡。最令人兴奋的是，在培养的原代神经元中，tm诱导的自噬活性在KO神经元中有缺陷。雷帕霉素和牛磺去氧胆酸可显著降低KO神经元CASP3的裂解。总之，这些数据提供了WDR45缺失导致自噬缺陷与内质网质量控制之间的完整联系；并提示β-螺旋桨蛋白相关神经变性病的潜在机制。图8 激活自噬或抑制UPR可挽救异常蛋白质加工并增加WDR45缺失细胞的细胞死亡小结该研究利用CRISPAR-Cas9构建了WDR45 基因敲除小鼠，然后利用RT-PCR、PRM分别从基因水平和蛋白水平验证WDR45的敲除效果。一系列动物行为学实验，包括morris水迷宫实验、8臂迷宫试验、条件性恐惧实验、旋转实验等结果显示WDR45基因敲除小鼠具有认知障碍。然后作者利用3 x 10标TMT实验从分子层面研究了小鼠大脑组织的定量蛋白质组学，发现在基因敲除小鼠中的积累了大量的内质网（ER）蛋白。而后作者从细胞水平上验证发现WDR45缺乏可引起内质网蛋白积累，从而导致内质网应激增加和内质网质量控制受损。未折叠蛋白反应通过ERN1/IRE1或EIF2AK3/PERK途径升高，最终导致神经元凋亡。通过MTOR抑制内质网应激或激活自噬可减少细胞死亡。因此，WDR45的缺失会削弱神经元的宏自噬机制，并导致细胞器自噬的损伤，提供了对BPAN病因的机制性理解和治疗这种遗传性疾病的潜在治疗策略。...
测序技术的普遍使用使得基因组学在基础科研、医学健康和农业生产中发挥的作用越来越大。在现代农业生产中，基因组学技术对于种质资源选育、品种改良、产量提升等方面的影响也进一步凸显。未来，农业基因组学研究在农业科学中发挥的引领作用将进一步增大，并将整体提升农业领域的竞争力。为加强农业基因组学领域的学术交流，2019年10月26日，由青岛农业大学、安诺优达生命科学研究院主办、安诺优达基因科技（北京）有限公司承办的第一届农业基因组学青年学术研讨会即将于青岛召开。大会将邀请农业基因组学研究领域的优秀专家学者进行学术报告。会议基本信息 会议名称：第一届农业基因组学青年学术研讨会会议地点：山东省青岛市城阳区长城路700号青岛农业大学学术会馆第一报告厅会议时间：2019年10月26日会议主办方：青岛农业大学、安诺优达生命科学研究院会议承办方：安诺优达基因科技（北京）有限公司 报告嘉宾 备注：以上报告嘉宾按姓氏首字母排序，排名不分先后 会议注册本次会议开通邮件注册入口，请将姓名、单位、联系方式等信息邮件发送至“service@genome.cn”邮箱即可完成报名，报名成功后会有邮件回执确认，注意查收邮件。备注：此次会议请听会嘉宾自行解决午餐和晚餐，会议期间会有精美茶歇等着您。 报名咨询邮箱：service@genome.cn电话：010-56315326转6174或与安诺优达当地销售经理联系咨询报名情况想知道大咖们都会做哪些报告吗？赶紧期待下周的官宣新闻吧。10月安诺优达与您相约青岛，我们不见不散~ 张忠华教授张忠华，教授，博士生导师。入选中组部“万人计划”科技创新领军人才和青年拔尖人才，获 “中国青年科技奖”，第二完成人获2018年国家自然科学二等奖，第一完成人获2018年中国农业科学院青年科技创新奖。中国园艺学会分子育种分会秘书长、青年分会常务理事，Journal of Integrative Agriculture (JIA)、Horticultural Plant Journal等期刊编委，中央国家机关青联委员，全国青联常委。在Nature、Science、Cell等期刊共发表SCI论文42篇，累计影响因子超过400，共被引用6000余次。主持国家重点研发计划课题1项，2013年获国家自然科学基金委“优秀青年”科学基金项目，主持国家自然科学基金面上项目3项，主持国家973和863计划子课题。安诺优达生命科学研究院2018年7月安诺优达生命科学研究院正式获批成立，研究院以利用生命科学技术推动科学研究及人类健康事业的发展为主线，以浙江安诺优达生物科技有限公司为依托，建设成国际知名的以基因组学、转录组学、表观组学等多组学为核心的研究中心、一流的测序中心和大型数据处理超级计算中心、三维基因组学研究中心和单细胞多组学研究中心，利用生命科学技术不断推动科学研究及人类健康事业的发展。 ...
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