凋亡检测操作流程
 
一、Annexin V 检测凋亡细胞膜的改变
 
试剂及溶液：
 
A．对于单独购买的试剂：
 
a) 10X Binding Buffer （货号：556454）：0.1 M HEPES，pH 7.4；1.4 M NaCl；25 mM CaCl 2。使用前稀
释至 1X。
 
b) Propidium Iodide（PI，货号：556463）：建议与以下试剂同时使用 Annexin V-FITC（货号： 556420,
556419）或 Annexin V-Biotin （货号： 556418，556417）
 
c) Via-Probe™ （货号：555816 ）：核酸染料 7-AAD。建议与以下试剂同时使用 Annexin V-PE（货号：
556422，556421）或 Annexin V-Biotin（货号：556418，556417）。
 
d) 1X PBS Buffer （货号： 554781）：8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.44 g Na2HPO 4 · 7H20, 0.24 g KH2PO4 , 加水至
1L。调整 pH 值至 7.2。 高压灭菌室温保存。
 
B．对于凋亡检测试剂盒（货号：556547）
 
a)  FITC Annexin V （组分编号： 51-65874X）：每个样本 5 μl 用量。
 
b)  Propidium Iodide （PI，组分编号： 51-66211E)）：现成的核酸染料。每个样本 5 μl 用量。
 
c)  10X Annexin V Binding Buffer（组分编号： 51-66121E）： 0.1 M Hepes/NaOH (pH 7.4), 1.4 M NaCl,
25 mM CaCl2.使用时用双蒸水配制成 1X。
 
操作步骤：
 
1．取 Falcon 试管，按标本顺序编好阴性对照管和标本管号。
 
2．使用冷的 PBS 缓冲液洗细胞两次，再用 1′ Binding Buffer 缓冲液制成 1′106 细胞/ml 的悬液。
 
3． Falcon 试管中加入 100 μl 细胞悬液。
 
4．按以下体积加入 Annexin V 与核酸染料：
 
管号          名称            荧光标记 Annexin V            核酸染料：
1           阴性对照                 -                         -
2            单阳 1               AV-FITC                      -

3            单阳 2                  -                         PI
4            样本                 AV-FITC                      PI

5．轻轻混匀，室温（20°C ~25°C）避光处放置 15 分钟。
 
6． *使用 Annexin V-Biotin 试剂进行检测时：
 
h  1′Binding Buffer缓冲液洗细胞一次，去上清。
 
h  1′Binding Buffer缓冲液100μl溶解SAv-FITC试剂0.5μg，加入到细胞管中。
 
h 轻轻混匀。加入5μl PI，室温（20-25°C）避光处放置15分钟。
 
7．各试验管中分别加入 1′Binding Buffer 缓冲液 400μl。1 小时内上流式细胞仪测定结果。

Annexin V Blocking 
 
待测细胞与未标记的重组 Annexin V 预孵育，然后进行实验，是 Annexin V 细胞凋亡检测的质量控制。
原理是预先阻断 Annexin V-FITC 的结合位点，这样可以证明 Annexin V-FITC 凋亡分析的特异性。
 
1.  使用冷的PBS缓冲液洗细胞两次，再用1′Binding Buffer缓冲液制成1′106细胞/ml的悬液。
 
2.  在5ml的培养管中加入100μl细胞悬液（约1′105个细胞）。
 
3.  加入5-15μg纯化的重组Annexin V。注意，不同的细胞系，以及凋亡的不同阶段，其Annexin V位点
饱和所需要的纯化的重组Annexin V含量不同。某些情况下，为达到最好效果，可以减少细胞数量，
0.5′105个细胞加5-15μg纯化的重组Annexin V。
 
4.  轻轻混匀，室温反应15分钟。
 
5.  加入5μl的Annexin V-FITC或/和PI，轻轻混匀，室温避光处放置15分钟。
 
6.  各试验管中分别加入1′Binding Buffer缓冲液400μl。
 
7.  1小时内上流式细胞仪测定结果。