磁珠捕获结合CE-LIF进行快速样品制备和单抗药N-端糖链的分析
现代制药领域增长最快的是生物治疗性药物。随着大量原研生物药的**即将到期，越来越多的生物仿制药和生物改良药产品，主要是单克隆抗体药物（mAbs）正在开发中。这个全球新兴的生物制药市场需要高灵敏度和分辨率的生物分析技术对产品进行表征，包括分析重要的翻译后修饰，如糖基化。在生物药物产品开发链的各个环节，均需要快速表征的方法，而糖基化正是其中的一个关键质量属性(CQA) 。因此在单克隆抗体药物生产过程中的所有步骤，均应密切监测其糖型。
单克隆抗体的糖基异构化主要取决于使用的宿主细胞系和表达条件。结构的多样性包括是否存在核心糖链的岩藻糖基化、不同的半乳糖苷化和唾液酸化以及二等分的N-端乙酰葡糖胺的存在。Fc端的CH2区保守糖基化结构（图1）影响生物活性、理化性质、抗体依赖的细胞毒性（ADCC）和补体依赖的细胞毒（CDC）。
图1. 左图为IgG1的结构图，右图为Fc端CH2区保守的糖基化结构
由于糖基参与所有关键的生物过程，因此糖型对于功能关系应视为质量源于设计（QBD）过程中的一部分。例如，核心岩藻糖基化是对ADCC的功能起到反作用的关键影响因素（较低的岩藻糖基化增强ADCC的功能）。二等分的N-乙酰葡糖胺GlcNAc的存在也会增加ADCC的功能。末端唾液酸化影响抗炎特性，而半乳糖基化提高CDC功能。在治疗性抗体药物中，对某些免疫原性糖残基，如α1-3半乳糖和N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）的微量分析也是非常重要的。对所有这些糖基化特征的深入分析需要贯穿生产过程中的每一个步骤，从克隆筛选到转染、细胞扩增、工艺过程开发生产和纯化，如图2所示。可能影响重组糖蛋白糖基化过程差异的因素有：宿主细胞系中加工酶的表达水平、单糖核苷酸供体的水平、细胞信号转导途径如细胞因子/荷尔蒙、培养基组分以及由于pH变化、基因突变、沉默和过表达造成的细胞器组织缺失和生物生产过程中的环境(温度，氧含量等)。因此，使用适当的分析工具来确保产品具备必需的糖基化，对于保证产品最佳的活性是很关键的。
图2. 重组治疗性抗体生产过程中涉及糖基化的主要步骤
用于表征治疗性蛋白N-端糖基化的方法有很多种，最常见的如毛细管电泳（CE），液相色谱（LC），质谱（MS）和核磁共振（NMR）。毛细管电泳技术（图3）的优势在于分离速度快，分辨率高和检测灵敏高。一直以来，很多生物制药企业利用毛细管电泳的多种模式结合紫外检测或荧光检测方法进行对单抗的表征，如毛细管区带电泳表征单抗的纯度和异质性，毛细管等电聚焦检测单抗的等电点和电荷异质性，毛细管凝胶电泳用于糖基化分析。并且研究探索了上述各毛细管电泳方法在不同实验室和不同操作人员间的可转移性以及优异的稳定性。
图3. 配置激光诱导荧光检测器的PA800 plus生物制药分析系统
本文将介绍一种磁珠辅助的样品处理方法，对治疗性单克隆抗体N-端糖基化进行快速的分析。所有的样品制备过程都可使用自动化的液体处理器完成，无需离心和过夜孵育。全部样品制备过程仅需要不到四个小时即可完成。
实验设计
化学试剂：IgG，醋酸，***钠（1M in THF）购于Sigma Aldrich （St. Louis, MO），8-氨基芘-1,3,6-三磺酸三钠盐（APTS），N-CHO Carbohydrate分离胶缓冲液，麦芽低聚糖标准品和Agencourt CleanSEQ 磁珠由贝克曼提供，PNGase F酶由ProZyme提供，酶解反应混合物按照厂家的说明书准备。
样品制备：根据厂家提供的PNGase F反应说明书，用PNGase F快速酶解糖基，50℃孵育1小时。之后加入200 μL磁珠（Agencourt CleanSEQ）的乙*悬浮液（最终乙*浓度为87.5%），磁珠可从多肽链和糖类内切酶的混合物中将酶切下来的糖基捕获。通过充分混合，将含有糖基磁珠混合物的离心管放入强磁场中进行快速分离。弃去上清液，向离心管中加入21 μL的APTS（40 mM于20%的醋酸中），以洗下捕获在磁珠上的寡糖链。
洗脱结束后立刻加入7 μL***钠（1M in THF）进行还原胺化反应。反应混合物在37℃孵化2小时，然后用酶解反应中相同的磁珠 （Agencourt CleanSEQ）去除多余的染料，乙*的最终浓度为87.5%。弃去上清液，加入25 μL水，将离心管放置在强磁场中，将APTS标记的糖基从磁珠上洗脱下来。含有APTS标记糖基的上清液用于CE-LIF分析。
毛细管电泳：实验使用的毛细管电泳仪为PA800 plus（由AB SCIEX提供），配置激光诱导荧光检测系统（激发波长488 nm，发射波长520 nm）。N-CHO分离毛细管的有效长度为50 cm（60 cm毛细管总长，50 μm内径）。施加的电场强度为500 V/cm，运用反向电压（进样端为阴极）。1psi（6.89 kPa）压力进样5秒。用32 karat工作站进行数据的采集和分析。
结果和分析
单克隆抗体的全面糖基化分析是一项具有挑战的任务，因为糖类通常具有非常复杂、多样化的结构。此外它们不具备任何的生色和荧光基团，不能使用液相分离技术的常规的检测手段进行检测。此外，大部分糖基结构不带电荷，在电场下很难进行分离。糖基检测的方法有核磁共振、质谱、高效液相色谱、毛细管电泳或联用技术（LC-MS，CE-MS）。其中，毛细管电泳结合激光诱导荧光检测可以很容易的解决上述问题，提供耐用、高效和高重现性的糖型分析方法。毛细管电泳的快速分析也适用于高通量的分离模式。与LC和大多数基于质谱检测的方法相似，使用毛细管电泳技术也需要进行样品的分离前的标记。APTS是毛细管电泳中最常用于糖分析的标记物，它可以在快速电泳迁移中提供荧光信号和分离必需的电荷。APTS与糖通过简单的一步反应形成的稳定结合物，APTS只能与糖的还原末端反应，因此保证了定量准确性（每个糖链结合一个荧光分子）。APTS的荧光特性使其可以使用PA800 plus中的488 nm激发的激光诱导荧光进行检测。
糖基的释放和荧光标记：首先要用合适的酶，PNGase F，将糖基从多肽上切割下来。针对于样品制备的要求，进行了孵育时间和温度的优化。糖基释放的优化条件是50℃孵育1小时。
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