如何分析啮齿动物嗅觉的不同特征

在荷兰格罗宁根大学的Martien Kas实验室工作的贝蒂·霍尼克斯（Betty Hornix），通过这篇文章向大家非常详细地描述了如何使用动物运动轨迹跟踪系统（EthoVision XT）进行视频跟踪设置并执行小鼠嗅觉测试。

嗅觉和行为

人与动物之间的相互作用取决于适当的嗅觉处理，当这个过程出现问题时，可能会影响正常的社交行为（Hornix等人，2018）。

正确分析嗅觉对于准确解释小鼠各种行为至关重要，尤其是观察社交行为。下面我们将描述如何进行嗅觉习惯/去嗅觉习惯测试。我们将解释如何DIY自己的测试笼，哪些准备工作是必要的，如何执行测试，以及如何使用动物运动轨迹跟踪系统（EthoVision XT）分析视频。

嗅觉习惯测试

嗅觉习惯/去嗅觉习惯测试（OHDT）评估动物是否能够检测和区分不同的气味。它由不同气味的连续呈现组成。我们使用了一系列的水、两种非社会性气味和两种社会性气味。

每种气味在持续2分钟的三次连续试验中呈现给动物（见以下时间表）。在这三次试验中，气味的嗅觉调查减少被定义为习惯化。当出现一种新的气味时，动物发现嗅觉增加时，会表现出一种被称为去嗅觉习惯的整体行为。

最少的试验操作

这里描述的方法，即嗅觉习惯/去嗅觉习惯测试，因为笼子内部不受干扰，所以涉及较少试验操作（Yang&Crawley，2009和Oumadi等人，2019）。由于气味刺激物（500 ul试管内的用棉花密封）不会接触笼子或笼子盖的任何部分，因此避免了交叉试验污染。

如何制作自己的测试笼

该测试可以在需要进行一些小调整的普通家庭笼中执行。每天测试的每只动物都使用一个单独的笼子，可以避免气味留在笼子里。

我们在笼子的短边烧了一个洞，用一个钉子在小锡罐上打了个洞。小锡罐用热胶粘在每个笼子烧过的洞里（见下图）。我们建议不要使用硅胶胶，因为气味很重，希望尽量减少分散注意力的气味。

气味将通过这个锡罐呈现给动物。这样，在测试过程中，保持笼子内部不会受到干扰。

测试前的必要准备

测试连续两天进行。第一天，动物适应了笼子，并准备好了气味管。此外，清洁笼子，并填充了小垫层。我们使用了一种非常温和的清洁剂来减少笼子里的气味。

适应和测试

动物适应试验笼

我们使用了500 ul的试管，通过锡罐向动物呈现气味。每只动物需要准备17根管子，管子的尖端切掉（见下图）。其中两个试管中充满了干棉签。在准备测试和执行的每一步中都必须戴手套，尽可能防止气味转移。

下午，每只动物都要适应测试笼30分钟，同时将一根带有干棉签的管子插入锡罐中。

嗅觉刺激的准备

测试当天上午，气味管准备就绪。我们使用了水、杏仁提取物、橙子提取物、幼年粪便、成年粪便。之所以选择杏仁和橙子提取物，是因为它们气味非常独特，但气味中性。

我们按照测试的顺序（蒸馏水>杏仁（1:15）>橙子（1:5）>社会气味1>社会气味2）在水中和试管中准备稀释液，在不同气味之间记得更换手套，不要触摸棉签的棉端（见上图）。不要混合气味是非常重要的！这是一项非常耗时的任务，所以要花足够的时间来准备一切。

执行测试

该测试总共需要49分钟，包括在开始时用一根新管握住一根干棉签进行5分钟的驯化。气味一次出现3次，每次持续2分钟，ITI为1分钟，总共15次试验（见上述时间表）。我们使用多视频录制软件（Media Recorder）从测试台上方录制视频。

动物可以自由探索试验笼。在准备气味时以及在动物变化之间需要非常小心（通过不断更换手套），以避免转移和混合气味。

多只动物可以在它们自己的测试笼中同时进行测试，只要注意准确呈现气味的时间，以便使用EthoVision XT 16成功进行自动分析。

使用动物运动轨迹跟踪系统（EthoVision XT）分析视频

在动物运动轨迹跟踪系统（EthoVision XT）中，当动物的鼻尖位于我们在3.5厘米锡罐周围数字标记的区域内时，我们测量了嗅气味所花费的时间。

数据的提取和可视化

数据以1分钟的时间段导出，并将每次试验的2分钟持续时间相加。我们通过绘制15次试验中嗅气味的时间来可视化结果。在这项实验中，习惯和去习惯对非社会性气味和第一种社会性气味都非常有效。这是显而易见的，因为在3次试验中，每种气味的嗅闻时间都有所减少。

此外，当气味变为新气味时，嗅闻时间会增加。此外，这些动物能够以类似的方式区分第一种社交气味和最后一种非社交气味。他们更难区分这两种社交气味。我们建议使用更独特的社交气味，例如不同品种或更大年龄差异的气味。

嗅觉的有效测试和自动化

总之，嗅觉习惯/去嗅觉习惯测试对于测试嗅觉功能和分离嗅觉行为中的不同特征非常有效。此外，这种方法使动物在测试过程中不受干扰，减少了动物压力，使用动物运动轨迹跟踪系统（EthoVision XT）自动化分析成为可能。

参考文献

1.Hornix, B. E., Havekes, R., & Kas, M. J. H. (2018). Multisensory cortical processing and dysfunction across the neuropsychiatric spectrum. Neuroscience & Biobehavioral Reviews.

2.Oummadi, A., Meyer-Dilhet, G., Béry, A., Aubert, A., Barone, P., Mortaud, S., Guillemin, G. J., Menuet, A., & Laugeray, A. (2019). 3Rs-based optimization of mice behavioral testing: The habituation/ dishabituation olfactory test.

3.Yang, M., & Crawley, J. N. (2009). Simple behavioral assessment of mouse olfaction. Current Protocols in Neuroscience, CHAPTER(SUPPL. 48).

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