Western Blot中的内参设定

来源: 上海联硕生物科技有限公司   2011-12-23   访问量:5303评论(0)

Western Blot中的内参设定
Western Blot(WB)是检测一个基因表达是否正确及表达量多少的首选方法。WB操作简单,既可以定性分析表达产物,同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。作为一种有活性的生物大分子,抗体和抗原的反应是比较复杂的,因此用来测定表达产物时存在着一定的不确定性。所以,在WB实验设计中加入良好的参照体系,对实验结果分析是非常有帮助的。 参照体系通常包括分子量Marker(用来确定蛋白条带对应的分子量大小),空白载体对照(如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照),已知量标准产物的正对照,此外还有内参。
内参是最容易被忽略的一项,如果要用WB比较不同条件下或者不同组织中,目的蛋白表达量的相对多少,等量的细胞上样才有比较的基础。特别表达量不高时,上样量的差别就很可能影响结果的分析,所以此时内参就显得尤为重要。
内参即是内部参照(Internal Control),对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins),它们在各组织和细胞中的表达相对恒定,在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在WB实验中,除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外,还需要进行内参的检测,以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差,保证实验结果的准确性。
蛋白浓度测定是比较各种样品间上样量的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法都存在局限性,不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量,适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质,相对于比色法来说,操作简单,但是容易受到平行物质的干扰,如DNA的干扰;且敏感度低,要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA,Bradford,Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高,且与一系列干扰Lowry,BCA 反应的还原剂(如DTT,巯基乙醇)相容。但是对于去污剂依然是敏感的,其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大,无可比性。另外,蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样,此步骤也存在操作误差。在WB实验时使用内参,即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。
在WB中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参,这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达,由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定,借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差,这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照,检测蛋白转膜情况是否完全、整个WB显色或者发光体系是否正常。
实验结果分析其实很简单:如果样品蛋白量有限,只够进行一次电泳转膜实验时,分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量,得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量,再用此数值进行样品间的比较和分析,得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分,可以先检测内参,观测样品间内参显色条带是否一致,根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验,至内参量一致为止;若内参一致,即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。常用的蛋白质内参有GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。



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