小动物活体成像技术概略

来源: 北京五洲东方科技发展有限公司   2017-12-12   访问量:1724评论(0)

活体成像是指生物体处于活体状态下,在细胞和分子水平上应用多种成像方式对某种生物行为进行定性或者定量分析研究的方法。与传统的体外成像或切片相比,其有许多优势:
1. 可用同一实验对象进行多次处理得到一系列结果,从而排除个体间的差异;
2. 能够在正常生理状态下检测活体内生物学活动,可真实模拟生理病理状态;
3. 可动态观察处理结果,不需要处死实验对象。
活体动物体内光学成像主要采用生物发光(bioluminescence)与荧光(fluorescence)两种技术。通过两种不同的标记方式,结合更高量子效率CCD来监测被标记动物体内分子及细胞等的发展进程。

生物发光是用荧光素酶基因(Luciferase)标记细胞或DNA, 荧光技术则采用荧光报告基团(GFP、RFP),或Cyt及Dyes等荧光染料进行标记。生物发光是自发光,而荧光发光成像只需要特定波长的光源照射便能释放出光子,无需其他因子。 那这两种方法各有什么优缺点呢?

以移植性小鼠肿瘤模型活体成像为例,一个完整的成像过程包括:
——构建报告基因
——细胞转染
——筛选
——建立稳定表达的细胞
——动物模型建立
——活体成像
细胞转染方法包括DEAE-葡聚糖法,磷酸钙法,阳离子脂质体法,阳离子聚合物法,病毒介导法,Biolistic颗粒传递法(基因枪粒子轰击法),显微注射法, 电穿孔法等。
动物模型制作可根据实验需要通过尾静脉注射、皮下移植、原位移植等方法接种已标记的细胞或组织。在建模时应认真考虑实验目的和选择荧光标记,如标记荧光波长短,则穿透效率不高,建模时不宜接种深部脏器和观察体内转移,但可以观察皮下瘤和解剖后脏器直接成像。深部脏器和体内转移的观察大多选用荧光素酶标记。
活体的成像过程。小鼠经过常规麻醉(气麻、针麻皆可)后放入成像暗箱平台,最好可选择带有温控台的暗箱,以维持小动物正常体温及代谢活动。在小动物麻醉的情况下,获得一张明场一张暗场的图片,最后两图像叠加后可以直观的显示动物体内特异光子的部位和强度。值得注意的是荧光成像应选择合适的激发和发射滤片。

实验影响因素:
如预实验时拍摄出图片非特异性杂点多,需降低曝光时间;反之, 如信号过弱可适当延长曝光时间。但曝光时间的延长,不仅增加了目的信号,对于背景噪音也存在一个放大效应。
同一批实验应保持一致的曝光时间, 同时还应保持标本相对位置和形态的一致, 从而减少实验误差。
进行荧光成像时,实验者可选择背景荧光低不容易反光的黑纸放在动物标本身下,减少金属载物台的反射干扰。
动物体内很多物质在受到激发光激发后,会发出荧光,影响结果。背景荧光主要是来源于皮毛和血液的自发荧光,皮毛中的黑色素是皮毛中主要的自发荧光源,其发光光线波长峰值在500~520nm左右,在利用绿色荧光作为成像对象时,影响最为严重,产生的非特异性荧光会影响到检测灵敏度和特异性。动物尿液或其他杂质如没有及时清除,成像中也会出现非特异性信号。

法国VilberNEWTON 7.0 小动物活体成像系统采用深度制冷CCD相机,-67℃低温,有效降低了背景噪点,暗电流仅有0.0002e/p/s;采用超大口径定焦镜头,提高了单位时间内的检测灵敏度。可长达2h以上的曝光,尤其适用于信号极其微弱的生物发光成像。



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