文献解读:一种由CRISPR-Cas9介导的基因编辑方法

来源: 武汉金开瑞生物工程有限公司   2018-2-6   访问量:915评论(0)

题目:A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging
期刊:Nature Communation
影响因子:12.124
主要技术:CRISPR-Cas9
研究背景
CRISPR-Cas9技术虽然使基因敲除变得简便,但标签插入依然由于每插入一个位点都需要针对该位点构建donor质粒且依赖自发的同源重组而显得昂贵且存在一定难度。本研究发现了一种能解决上述问题的基因标签插入方法,该方法只需构建一个donor质粒即可用于所有位点的精准的标签插入且不依赖于同源重组。
研究内容及结果
1. 本研究首先构建了能表达斑马鱼tia1l基因sgRNA的donor质粒,该质粒在Cas9蛋白的存在下能释放杀稻瘟菌素CDS,与携带Cas9蛋白和特定位点sgRNA的质粒共转入大多数基因都只有1个拷贝的HAP1细胞中,初步评估了杀稻瘟菌素CDS插入的效率,6个基因12个位点中有11个成功插入了杀稻瘟菌素CDS。
2.对上述筛选到的成功插入杀稻瘟菌素CDS的细胞进行克隆分离并检测发现,12个单克隆中有11个是在PAM位点前3个碱基处精确插入杀稻瘟菌素CDS。
3.qPCR检测野生HAP1细胞中分别用IFNβ、Activin A、FGF1诱导0、4、8、24h后,IFIT1、DACT1、EGR1的表达了均上调。将NanoLuc报告基因分别插入IFIT1、DACT1、EGR1,加入诱导剂后 IFIT1、DACT1、EGR1的表达量均上调。NanoGlo荧光素酶检测结果与qPCR结果一致,表明本研究中使用的标签插入方法能用来监控内源基因的表达。
4.运用上述的标签插入方法在HAP1细胞内源基因LMNA、TERF1、LAMP1中插入荧光标记基因TurboGFP并用流式细胞术富集成功插入标签的细胞,以用于活细胞成像研究,可以对目标基因表达产物进行精准定位。
文章小结
运用本研究中的标签插入方法,可以对目标细胞系靶基因定点插入NanoLuc、TurboGFP或其他标签,实现对靶基因表达量的监控或进行亚细胞定位。该方法比传统的依赖于同源重组双交换的标签插入方法更加省时,操作上更为便捷,且一个donor载体可以用于不同基因不同细胞的同一种标签插入,节约成本。
解析文献
Daniel H. Lackner, Alexia Carre´, et al. A generic strategy for CRISPR-Cas9-mediated gene tagging [J]. Nature Communications,2015,6:10237.
参考文献
1.Auer, T. O., Duroure, K., De Cian, A., Concordet, J. P. & Del Bene, F. Highly efficient CRISPR/Cas9-mediated knock-in in zebrafish by homologyindependent DNA repair. Genome Res. 24, 142–153 (2014).
2. Maresca, M., Lin, V. G., Guo, N. & Yang, Y. Obligate ligation-gated recombination (ObLiGaRe): custom-designed nuclease-mediated targeted integration through nonhomologous end joining. Genome Res. 23, 539–546(2013).
3. Cristea, S. et al. In vivo cleavage of transgene donors promotes nucleasemediated targeted integration. Biotechnol. Bioeng. 110, 871–880 (2013).
4. Ran, F. A. et al. In vivo genome editing using Staphylococcus aureus Cas9. Nature 520, 186–191 (2015).
5. Cong, L. et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science 339, 819–823 (2013).



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