【SCI 20分客户成果】P53响应的lncRNA GUARDIN参与维护基因组的稳定

来源: 上海康成生物工程有限公司   2018-6-13   访问量:1828评论(0)

中国科学技术大学吴缅教授团队多年来在肿瘤细胞凋亡/生存的信号转导及分子机制,非编码RNA调控肿瘤发生发展的分子机理,p53与细胞代谢及诱导性多能干细胞调控的分子机制方面做出了很多开创性的研究成果。近期,研究团队应用Arraystar Human LncRNA Array对带有WT p53表达系统以及没有p53表达的H1299人肺腺癌细胞的lncRNA表达谱进行了研究,研究筛选出了一个受p53调控的lncRNA GUARDIN,一系列功能机制实验研究表明p53响应的lncRNA GUARDIN对稳定状态下和暴露于外源性遗传毒性胁迫后维持基因组完整性非常重要,GUARDIN主要通过竞争性结合miR-23a调控TRF2的表达,以及作为支架分子促进BRCA1和BARD1的结合维持BRCA1的稳定性来发挥相应功能。该研究表明GUARDIN可以作为癌症治疗的潜在新靶标,相关研究成果发表在国际著名学术期刊Nature Cell Biology(IF = 20.06)杂志上。(芯片实验由Aksomics提供技术服务)


研究背景
基因组稳定性的维持是一切生命活动的基础,DNA损伤和复制应激都将影响基因组的稳定性。研究显示,DNA损伤应答及修复的失调与肿瘤的发生、发展有密切的关系。为了应对代谢活动或者环境损害导致的DNA损伤,细胞会不间断激活DNA损伤应答(DDR),识别和修复DNA损伤以维持基因组稳定性。肿瘤抑制因子p53是DDR重要的调控因子,通过细胞周期阻滞促进DNA修复,并通过诱导细胞凋亡消除具有严重DNA损伤的细胞,维护基因组的稳定,从而抑制肿瘤的形成。p53的转录靶点包含广泛的蛋白质编码基因,最近的研究揭示了许多长链非编码RNA(lncRNA)能参与调节对DNA损伤的p53依赖性应答,然而关于lncRNA是如何介导了肿瘤抑制因子p53的DNA修复功能目前仍然不是很清楚。

本研究中作者利用Arraystar lncRNA芯片发现了一种p53响应的lncRNA GUARDIN对于维持基因组稳定性是非常必要的。 GUARDIN主要是通过两种分子作用机制来维持基因组的稳定性:第一、作为分子海绵吸附miR-23a调控端粒重复序列结合因子(TRF2)的表达来维持染色体末端结构的完整性;第二、作为分子支架促进BRCA1与BARD1的结合进而调控BRCA1的表达进而维持细胞的DNA修复能力,GUARDIN对于细胞存活和增殖也是必不可少的,因此,GUARDIN在癌症治疗中也有非常重要的研究意义。

研究思路
首先作者应用Arraystar Human LncRNA Array对带有WT p53表达系统以及没有p53表达的H1299人肺腺癌细胞的lncRNA表达谱进行了研究,研究筛选出了一个受p53调控的lncRNA GUARDIN。qPCR验证与芯片结果一致,生信分析发现GUARDIN有三个异构体,其中最长的亚型在p53诱导时含量最丰富。接下来作者通过过表达/敲除p53、qPCR、WB、免疫沉淀等实验验证了GUARDIN是p53响应的lncRNA。
随后作者对GUARDIN的功能进行了研究,HTC116细胞中,敲除GUARDIN,细胞数目、细胞活力、克隆形成及异种移植物都明显下降,表明GUARDIN是细胞存活和增殖所必需的。
最后作者对GUARDIN的分子机制进行了研究。GUARDIN主要定位于细胞质中,因此作者通过miRDB数据库对其结合的miRNA进行了分析,发现GUARDIN可以结合miR-23a,随后通过miR-23a模拟物/抑制剂荧光素酶报告检测及pull down等实验证明GUARDIN可以结合miR-23a且主要发生在细胞质中。同时通过敲除GUARDIN及anti-miR-23a发现,GUARDIN可以调控miR-23a的靶基因TRF2的表达。接下来作者通过RNA pull down结合质谱以及RIP、WB等实验,发现GUARDIN可以和BRCA1以及BARD1相互作用,通过敲除及突变GUARDIN外显子实验,证明GUARDIN可以作为分子支架介导BRCA1与BARD1的相互作用来调控BRCA1的表达。然后作者通过DNA损伤彗星实验发现,GUARDIN敲除后,DNA损伤加剧等,表明了GUARDIN对基因组稳定性的作用,而且TRF2和BRCA1共同过表达可以消除GUARDIN下调引起的DNA损伤。上述实验表明GUARDIN可以通过调控TRF2和BRCA1的表达促进基因组稳定性。

技术路线

结果展示


图1 芯片筛选lncRNA验证及GUARDIN受p53调控分析结果


图2 GUARDIN功能研究结果,对细胞存活和增殖是必需的


图3 GUARDIN机制研究结果,可竞争性结合 miR-487b调控TRF2表达以及介导BRCA1和BARD1互作调控BRCA1表达


图4 GUARDIN机制研究结果,通过调控TRF2和BRCA1维持基因组稳定性

研究意义
在这项研究中,研究人员通过Arraystar lncRNA芯片筛选出了p53响应的lncRNA GUARDIN,通过一系列功能机制实验表明GUARDIN竞争结合mi-23a促进TRF2表达,维持染色体末端结构的完整性,GUARDIN促进BRCA1与BARD1的结合而稳定BRCA1,维持细胞的DNA修复能力。GUARDIN对细胞存活和增殖也是必需的,具有潜在的抑癌效应,可能成为癌症临床药物治疗的潜在靶标。

原文出处
GUARDIN is a p53-responsive long non-coding RNA that is essential for genomic stability. Nature Cell Biology, 2018



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