RNA-蛋白相互作用研究揭示视网膜母细胞瘤发生的染色体构象调控新机制

来源: 上海康成生物工程有限公司   2018-8-15   访问量:1275评论(0)

上海交通大学医学院附属第九人民医院范先群教授主攻眼部肿瘤和眼眶外科,在基础研究和临床治疗方面取得突出成就。其带领的眼肿瘤团队利用ChIRP-MS技术(一种研究RNA-蛋白相互作用的技术手段)结合RNA-seq、ChIP等一系列体内体外实验对视网膜母细胞瘤新的作用机制进行了深入研究。研究发现肿瘤细胞中Ch12p 13.32染色质开放,激活一种新型lncRNA GAU1表达,GAU1可以在致癌基因GALNT8启动子区富集,招募转录因子TCEA1到启动子区,促进其表达,从而影响肿瘤的发生,该研究提出了一种新的染色质动力学的致癌机制,同时该研究临床数据分析还发现高表达GAU1预示着更低的患者生存率,为视网膜母细胞瘤患者早期诊断和预后生存提供重要检测指标和治疗新靶点。该研究成果近期发表在国际著名学术期刊Nucleic Acids ResearchIF:11.561)杂志上。(ChIRP-MS实验由数谱生物提供技术服务


研究背景

染色质结构的变化可以调控基因在转录,复制,重组和损伤修复过程中对调节因子的结合能力。开放染色质暴露许多游离转录因子的结合表面,而闭合染色质表现出密度增加和模糊蛋白结合位点。染色质动力学的破坏导致异常基因表达,染色体易位以及肿瘤发生等,因此,染色质动力学在人类疾病的发病机制中受到越来越多的关注。

动态染色质的异常转化会使蛋白质编码基因表达失调,可能是肿瘤发生的重要诱导物,染色质动力学还可以调控长链非编码RNA(lncRNA)表达以影响肿瘤形成。然而,在肿瘤发生中,染色体结构的动态变化是否可以同时调节长链非编码RNA和蛋白质编码基因仍然不确定。在我们的研究中,我们首次鉴定了一种新的动态染色体驱动机制,可以共激活chr12p13.32中的基因簇,即一种新的lncRNA GAU1和一种蛋白质编码基因GALNT8,通过RNA-seq、ChIRP-MS等一系列体内体外实验发现GAU1可以在致癌基因GALNT8启动子区富集,招募转录因子TCEA1到靶基因启动子区,促进其表达,从而影响肿瘤的发生。


研究思路

首先作者对视网膜母细胞瘤组织染色质动力学进行了研究,RNA-seq、FAIRE发现chr12 p13.32在肿瘤细胞中处于开放状态,可以激活LOC101929549和蛋白质编码基因GALNT8。qPCR、WB发现GALNT8和LOC101929549在肿瘤细胞中显着过表达。并且开放染色质的组蛋白信号在LOC101929549 / GALNT8基因座中显着增加。随后作者通过生信分析、载体构建、免疫荧光分析以及WB等实验确定LOC101929549没有蛋白编码能力,属于一种新型lncRNA,并命名为GAU1。

接下来作者对GAU1/GALNT8的功能进行了研究,体外敲除/过表达GAU1/GALNT8发现,敲除会导致集落形成降低以及细胞周期受到抑制,而过表达则会促进这些作用。体内原位移植实验表现出跟体外实验一样的预期结果。表明GAU1/GALNT8可以发挥促癌基因作用,调控肿瘤发生。qPCR和免疫组织化学染色发现GAU1/GALNT8在视网膜母细胞瘤组织中明显上调,TCGA、R2、Dorsman等数据库分析及KM曲线分析发现,GAU1/GALNT8高表达对应较差的预后,可以作为潜在指示肿瘤发生的biomarker。

最后作者对GAU1/GALNT8的作用机制进行了研究。核质分离及RNA-FISH发现GAU1分布于细胞核中,载体构建、qPCR、WB等实验发现GAU1可以顺式调控下游靶基因GALNT8的表达。然后作者通过ChIRP对lncRNA GAU1进行了研究,ChIRP-PCR、ChIRP-MS、ChIP、WB、qPCR等实验发现,GAU1可以在GALNT8启动子区显著富集, TCEA1可以和GAU1/GALNT8启动子区相互作用,以上结果表明在视网膜母细胞瘤中,开放染色质促进GAU1/GALNT8的共激活,GAU1可以招募转录因子TCEA1到致癌基因GALNT8启动子区,促进其表达,从而促进肿瘤发生。


技术路线


结果展示

图1 染色质动力学研究结果,肿瘤组织中Chr12p 13.32区域染色质开放,导致GAU1和GALNT8共激活,且GAU1属于新型lncRNA


图2 功能研究结果,GAU1/GALNT8促进肿瘤发生,高表达对应较差预后


图3 机制研究结果,GAU1是核lncRNA,调控GALNT8表达


图4 深入机制研究结果,GAU1在GALNT8启动子区富集,招募转录因子TCEA1结合到启动子区,激活其表达,促进肿瘤发生

研究意义

在这项研究中,研究人员通过ChIRP-MS技术结合RNA-seq、ChIP等一系列体内体外实验对视网膜母细胞瘤新的作用机制进行了深入研究。肿瘤细胞中12号染色体13.32区域染色质处于开放状态,可以激活一种新型lncRNA GAU1表达,GAU1可以在致癌基因GALNT8启动子区富集,招募转录因子TCEA1到靶基因启动子区,促进其表达,从而影响肿瘤的发生,该研究呈现出一种新的染色质调整的动力学机制。同时为视网膜母细胞瘤患者早期诊断和预后生存提供重要检测指标和治疗新靶点。


原文出处

Dynamic chromosomal tuning of a novel GAU1 lncing driver at chr12p13.32 accelerates tumorigenesis. Nucleic Acids Research, 2018



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