荧光原位杂交技术概览

来源: 北京安必奇生物科技有限公司   2019-1-8   访问量:3256评论(0)

 

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荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)是在放射性原位杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子细胞遗传技术,以荧光标记取代同位素标记的原位杂交方法,是利用荧光标记的DNA探针来检测在细胞、组织和肿瘤的特定DNA序列的强大分子诊断技术。通常用于遗传咨询,医学和品种鉴定、DNA特定功能研究,利用FISH方法还可检测非整倍体,微缺失综合征以及基因重排等,这些指标对很多遗传性疾病,如白血病,淋巴瘤,实体瘤,自闭症等发育综合征有重要的临床意义。


FISH技术原理

荧光原位杂交技术(fluorescence in situ hybridization,FISH)是根据核酸碱基互补配对原理,用半抗原标记DNA或者RNA探针与经过变性的单链核酸序列互补配对,通过带有荧光基团的抗体去识别半抗原进行检测,或者用荧光基团对探针进行直接标记并与目标序列结合,最后利用荧光显微镜直接观察目标序列在细胞核、染色体或切片组织中的分布情况。

FISH 技术特点

原位杂交的探针按标记分子的类型分为放射性标记和非放射性标记。同位素标记的放射性探针优势在于对制备样品的要求不高,可以通过延长曝光时间增加信号强度,故较为灵敏,但是探针不稳定,自显时间长,放射线的散射使得空间分辨率不高,操作繁琐。FISH技术则可以克服这些缺点。

优势:

1,操作简便,探针标记后稳定,一次标记后可使用2年。

2,方法灵敏,能迅速得到结果。

3,在同一标本上,可同时检测几种不同探针。

4,不仅可以用于分裂期细胞染色体数量或者结构变化的研究还可以用于间期细胞的染色体数量及基因改变的研究。

5,分辨率高达3-20Mb

缺点:不能达到100%杂交,特别是在应用较短的cDNA探针时效率明显下降。

探针和标记

荧光原位杂交探针的类型十分广泛,大小可以从几Mb到几bp。探针的获得可通过克隆、酶扩增及化学方法合成,多种探针的使用使得FISH技术成为一个多功能原位研究DNA和RNA结构和功能的方法。

FISH技术种类甚多,发展迅速,其实现需要获得能与靶序列互补结合的探针。常用的探针有以下三类:1、染色体重复序列探针,主要是指着丝粒α-卫星DNA重复序列探针和端粒重复序列探针,用以检测染色体数目异常,同时由于G显带时,端粒区是苍白的,因此涉及此区的易位常难以检测,而应用端粒探针则弥补了G显带的不足;2、全染色体区域特异性探针,由一条染色体或其上某一区域的极端不同核酸片段组成,可用于中期染色体重组和间期核结构分析;3、位点特异性探针,常有一个或几个克隆序列组成,主要进行染色体克隆DNA序列定位,检测靶DNA序列拷贝数及结构变化。

探针标记

探针的荧光素标记可以采用直接和间接标记的方法。

间接标记:采用生物素标记的DNA探针,杂交以后用偶联有荧光素,亲和素的第二抗体进行检测,同时还可以利用亲和素-生物素-荧光素复合物,将荧光信号进行放大,从而检测达500bp的片段。

直接标记:将荧光素直接与探针核苷酸或磷酸戊糖骨架共价结合,或在缺口平移法标记探针时将荧光素核苷三磷酸掺入。直接标记法在检测时步骤简单,但不能进行放大信号,灵敏度不如间接标记法。

Fish技术应用

该项技术目前已广泛应用于动植物基因组结构研究,染色体精细结构变异分析,病毒感染分析,微生态分析,肿瘤遗传学和基因组进化研究等许多领域。

1,在染色体结构研究中的应用 

荧光原位杂交简化了染色体结构变异的检测。如植物染色体的非整倍体是由于染色体行为异常,即可能是双亲配子染色体数目和结构差异引起或染色体亲缘关系较远等因素导致。利用原位杂交可比较容易地检测出缺失、附加或替换的染色体。

2,FISH在基因定位中的应用:

FISH可以直接测DNA序列在染色体上的定位情况,基因的染色体定位是FISH在分子生物学上应用的重要方面。PP2Ac突变型肺癌相关基因在染色体区域的定位,荧光显微镜下观察记录和分析杂交信号的特征。结果在正常人淋巴细胞的染色体5q23-31可见明显杂交信号,在GLC-82细胞的5号和7号染色体上出现较强信号。说明点突变引起PP2Ac活性改变,从而基因易位,导致肺肿瘤的产生。

3,在微生物生态学的应用

FISH技术具有很多优点,如快速、准 确、原 位等,因而目前在微生物生态学各个领域研究中已成为了强有力的工具。比如环境样品中微生物多样性的检测;污水处理相关微生物多样性研究;内共生微生物研究;也可以分析有些复杂微生物,比如口腔,胃肠道菌群。

4,血液肿瘤检测 

血液肿瘤是我国十大高发肿瘤之一,随着对疾病发病机制的深入研究,发现细胞遗传学对肿瘤分型、诊断、治疗和预测预后都具有重要的意义。在临床上对血液肿瘤的FISH检测主要集中在以下几个方面:①染色体异位形成的融合基因检测。②基因缺失的检测。一些关键基因的缺失有助于我们对肿瘤进行诊断以及预后判断。③微小残留病灶的检测。④对异性间造血干细胞移植的植入状态监测。

5,实体瘤中的应用 

FISH几乎可以快速检测任何类型组织细胞的染色体异常,不管组织是新鲜的或是一些甲醛溶液(福尔马林)固定的陈旧组织标本。因此,FISH被广泛接受用于乳腺癌、膀胱癌、宫颈癌、肺癌、淋巴瘤等实体瘤的辅助诊断,其目的主要集中在对肿瘤的早期诊断、疗效检测、个体化治疗和预后判断等几个方面。

参考资料

荧光原位杂交技术的研究及其应用

荧光原位杂交技术的研究进展

荧光原位杂交技术的研究进展及其在染色体识别应用中的展望

Rapidone-day fluorescence in situ hybridization in prenatal diagnosis using uncultured ammiocytes and chorionic villi

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