NGS性能验证现状分析

来源: 菁良基因科技(深圳)有限公司   2019-6-3   访问量:1855评论(0)

我已经做过很多次NGS了,标准流程也都有了,为什么还需要进行性能验证?


作为全球领先的分子诊断标准品研发生产商,菁良常常收到这样的提问,NGS除了受人员、场地、仪器/试剂、操作流程等因素影响以外,由于整个过程涉及的环节太多,每一步骤都容易产生误差影响最终的检测结果。


影响NGS性能的因素

国家卫计委张瑞博士的报告中对为什么要进行NGS的性能验证做了详细描述。
1. 样本提取效率低
2. 自动化提取可能会导致样本交叉污染
3. 文库构建标签或者接头可能无效连接
4. 探针捕获效率低
5. PCR过程产生较大偏倚
6. 测序仪本身有一定的测序错误率
7. 测序仪光路偏倚,导致测序碱基质量低
8. 变异检测错误
9. 加入的标签识别错误
10. 实验室污染,人员能力差异,
11. 选用的软件错误,例如GATK Indelocator不能检测超过20个核苷酸的插入缺失
12. 注释差异,注释错误
13. 体细胞突变不能有效识别,未能精确过滤胚系突变
14. 数据分析参数设置不理想,数据过滤太多

上述一系列的原因,导致使用不同的流程,不同的实验室做出来的结果,测序质量和信息分析的结果不尽相同。


2015年实体肿瘤体细胞突变高通量测序检测能力调研结果

在2015年的实体肿瘤体细胞突变高通量测序检测能力调研中,也发现下列结果:

✦ 16.7%(12/72)实验室完全正确

✦ 449个错误结果

✦ 201个假阴性结果(201/449,44.8%)

✦ 222个假阳性结果(222/449,49.4%)

✦ 26个小错误(26/449,5.8%)


解决方案

面对以上诸多的影响NGS性能的因素,我们要从哪些方面进行验证呢?
张博士在报告中给出了详细的建议,作为全球领先的分子诊断行业标准品研发生产商,菁良也给出了相应的解决方案。

1. 精密度:突变结果是可以重复检出的吗?
菁良基因解决方案:

• 使用同一批次的菁良基因FFPE标准品,分多次提取,验证提取效率;

• 使用同一批次的菁良基因gDNA/ctDNA/RNA/fcDNA,重复建库,通过相同的文库检测指标,来衡量建库重复性;

• 使用同一批次的菁良基因gDNA/ctDNA/RNA/fcDNA,一次建库,分批次上机,验证测序重复性;

• 相同的提取,建库,测序条件,使用不同的信息分析流程,验证流程的重复性;


2. 准确性:突变检测结果是正确的吗?阳性的结果能检出阳性,阴性的结果能检出阴性吗?
菁良基因解决方案:

  • 使用已知突变位点,突变类型,突变频率的菁良基因阴阳性标准品,来验证检测结果的准确性。


3. 分析敏感性-检测下限:能正确检出最低多少浓度的突变位点?
菁良基因解决方案:

  • 通过低频的菁良基因gDNA,ctDNA标准品,例如2.5% 肿瘤SNV gDNA标准品,和将要推出市场的ctDNA(可检测低至0.1%)套装,分梯度检测流程下限。


4. 分析特异性-干扰物质:某些物质是否会对结果产生影响?
菁良基因解决方案:

  • 将菁良基因标准品掺入别的干扰物质,例如:1% 肿瘤结构变异ctDNA标准品,掺入正常人血浆。


5. 可报告范围:能够可靠检出突变的区域?
菁良基因解决方案:

  • 菁良基因的gDNA,ctDNA标准品突变位点,分布于不同的外显子区域,根据检测结果准确性,可以大致判断检测范围。





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