啊......,做WB好多杂带,怎么办?

来源: Cell Signaling Technology,Inc(China)   2019-6-9   访问量:3825评论(0)

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新抗体做WB,总在目的条带附近出现非特异性条带,百思不得其解?开门见山,先长按识别二维码来测一测原因,CST技术给您详细剖析解决方案:

 

有童鞋看到杂带,只怀疑抗体的原因,测完之后,您还认为——


“非特异性”条带一定是抗体的锅吗?

 

 

 

 

当然不是。对于CST的抗体,都是内部研发生产并且经过多重交叉验证之后才提供给客户的,CST尽全力保证出厂的抗体都具有高灵敏度、高特异性、高度可重复性。如果您用CST抗体出现多条非特异性条带,除了考虑一抗的因素,您还需要考虑以下几个因素

. 1 .

原因:细胞系传代次数过多,蛋白表达谱发生变化。

建议:使用未传代或传代次数较少的细胞系(不超过15代)进行样品制备。

 

. 2 .

原因:与细胞系裂解物相比,原代细胞或组织提取物会倾向于有较高的背景和降解条带。

建议:1. 用新鲜提取的,经过超声处理的澄清的组织提取物能降低背景。
2. 同时,用去垢剂含量较高的RIPA buffer裂解组织,可得到裂解更彻底、一致性更高的裂解物。

 

. 3 .

原因:蛋白被降解。

建议:1. 提取液确保含有蛋白酶抑制剂,并超声;

2. 蛋白样品提取后分装-20℃或-80℃短期保存,避免反复冻融,有条件尽量用新鲜提取的蛋白。

 

. 4 .

原因:蛋白本身有很多修饰。

建议:查阅文献,确定目的蛋白是否存在多种修饰,泛素化、糖基化等修饰会让蛋白的条带发生较大的偏移。

 

. 5 .

原因:所检测蛋白存在多种剪接体,导致分子量大小不同。

建议:查阅文献或者通过搜索数据库来确定该蛋白是否存在多种长度不同的编码mRNA。

 

. 6 .

原因:蛋白存在二聚体或多聚体。

建议:SDS loading buffer中现用现加β-巯基乙醇或DTT。

 

. 7 .

原因:样本存在外源转入蛋白。

建议:检查所用样本是否有过被外源进去带有标签的靶标蛋白。如有,更换细胞系样本。

 

. 8 .

原因:上样量过多。

 

建议:根据靶标表达情况,梯度上样跑胶后选择合适的上样量,通常20-50µg即可。

 

. 9 .

原因:实验操作与CST推荐的步骤有较大出入。

 

建议:1. CST推荐封闭液用5%脱脂奶粉/TBST,室温1h;
2. 一抗稀释液、稀释比参考抗体说明书,推荐4℃过夜孵育;
3. 二抗用5%脱脂奶粉/TBST稀释,工作浓度切忌过高,室温孵育1h;
4. 要用1XTBST缓冲液充分洗涤。

 

我们通过两个案例来具体分析下:

实验条件:检测靶标Phospho-Akt (Ser473);使用抗体:CST #4060S Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb;细胞系:MCF7。

 

 

问题:出现非特异性条带。Phospho-Akt (Ser473)(绿色)检测出2条带,一条在预测分子量60kd左右,另外一条稍大,两条bands强度差不多。红色荧光为内参蛋白β-Tubulin。

解决方案:建议客户复苏传代较少的细胞,重新刺激、裂解之后,即得到了单一的条带。

 

问题分析:AKT激酶由3个分子量非常相近的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶组成:AKT1, AKT2和AKT3。Phospho-Akt (Ser473)正常情况下应该只有1条带,但在某些特定条件下,AKT还可以发生糖基化、泛素化等修饰,从而造成蛋白大小发生改变。在这个案例的沟通中,我们发现客户之前使用的细胞系传代超过了25代,所以重新用较少代数的健康细胞,用了同样的抗体,最终得到了单一条带。

 

国内许多实验室细胞传代并不严格记录传代次数,以至于很多老师使用的细胞自己也都不知道多少代,所以这些细胞系里蛋白表达谱是否发生变化,甚至这些细胞系是否有被其他细胞或支原体污染等问题也不得而知。因此,我们呼吁老师们重视细胞系的培养,定期排查细胞污染,控制传代次数,只用健康的细胞,确保实验可靠。

 

☞ 关于支原体污染对蛋白条带的影响,推荐阅读:

 

养细胞,做WB不知道这点?一开始你就输了!

这个有意思的案例起源于生命科学联合中心、北京大学基础医学院系统生物医学研究所尹玉新教授课题组2017年的一篇发表在Nature Communications上的文章。作者先用全长的PTEN抗体检测到一个比PTENα稍小的“杂带”,同时“杂带”的表达模式与PTENα类似(图2.a)。如果作者认定这个“杂带”是抗体非特异性识别,不进行下面的深入研究,那就没有这篇大文章了。

 

 

当时,作者在探究精神激励下,又用只识别PTEN C-terminal domain的CST抗体 #9559 PTEN (138G6) Rabbit mAb(图2.b)和识别N端的PTENα抗体(图2.c)在不同的癌症细胞系中检测,加上后续一系列分析和质谱验证,证实最开始看到的那条“杂带”是和PTENα类似的N-terminal extended PTEN isoform,后命名为PTENb,从而使人们对PTEN蛋白家族及其功能的多样性有了更深刻的认识。

 

 

图2、 a~c引用自尹玉新教授课题组Nat. Commun. 8, 14771文章的Figure 1. ,d来自网络图片。

 

注:在b图中可以看到,PTEN-null的PC3细胞系中抗体并没有任何条带,证实其他细胞系中得到的PTEN条带是特异的

 

如果一个蛋白有多个isoforms,或蛋白同时发生多种翻译后修饰(PTM),理论上只要CST抗体的抗原表位识别的区域在这些isoform或PTM的上面,并且蛋白的表达量达到可检测水平,抗体都是能够识别到的。这是CST抗体性能优异的证明。

 

 

看来,如果您发现使用CST抗体检测到“非特异性条带”,先进行以下排查:

  1. 细胞样本:有没有被污染,有没有传代过久;组织样本:存储时间和条件是否得当,有没有发生降解。

  2. 样本提取:是否新鲜提取,是否加蛋白酶/磷酸酶抑制剂,是否超声。

  3. 有没有严格按照网站上产品页面提供的实验步骤进行实验操作。

  4. 查询数据库确认:靶标蛋白是否有多种isoforms、影响蛋白大小的蛋白翻译后修饰或容易出现多聚体等情况。

 

最后,祝大家好运!

 

 

 

参考文献】

1.Liang, H. et al. PTENβ is an alternatively translated isoform of PTEN that regulates rDNA transcription. Nat. Commun. 8, 14771 doi: 10.1038/ncomms14771 (2017)

 


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