显微成像小课堂丨etaluma让你的显微世界更清晰

来源: 锘海生物科学仪器(上海)股份有限公司   2019-6-20   访问量:2037评论(0)

我们的显微镜小课堂已经许久未和大家见面了,主要是因为我们的老师参与到了公司新仪器的研发中。截至目前,新仪器的研发工作已经告一段落,相信在不久的将来,大家就能看到锘海自主研发显微镜的发布新闻啦。言归正传,上节课我们简单的介绍了活细胞系统。接下来,显微镜小课堂将从构成活细胞系统的几个主要组成部分入手,为大家一点点揭开活细胞显微镜的世界。


Lesson Two 物镜及物镜参数

首先要说明的是,物镜是一个镜组,而不是指的单独一块透镜。相对于目镜来说,物镜也可以理解为被检物端的镜组。物镜是显微镜最重要的光学部件,利用光线使被检物体第一次成像,因而直接关系和影响成像的质量和各项光学参数,是衡量一台显微镜质量的首要标准。

物镜通常由透镜组组合而成,各镜片间彼此相隔一定的距离,以减少相差。每组透镜都由不同材料、不同参数的一块或数块透镜胶合而成。物镜有许多具体的要求,如合轴,齐焦。齐焦即是在镜检时,当用某一倍率的物镜观察图像清晰后,在转换另一倍率的物镜时,其成象亦应基本清晰,而且像的中心偏离也应该在一定的范围内,也就是合轴程度。齐焦性能的优劣和合轴程度的高低是显微镜质量的一个重要标志,它是与物镜的本身质量和物镜转换器的精度有关。

显微镜物镜是活细胞成像最重要的组成部分是,在各种选择中,首先需要确定三个参数:数值孔径(NA)工作距离,和放大倍率。其中,数值孔径是最关键的特征,因为该值决定了横向和轴向分辨率极限以及收集光的数量(其实就是可以达到的分辨率和对比度)。物镜数值孔径范围从0.1到1.45,数值越大,分辨率越高。高数值孔径(大于1.0)的物镜具有较短的工作距离(距盖玻片的最大焦距),并且在物镜顶透镜和盖玻片之间需要特殊的浸入介质,如水、油或甘油。在物镜选择中,工作距离往往被忽视,但对于较厚的动植物组织切片成像来说,工作距离显得尤为重要。放大倍率决定了样品将以多大呈现,但也可以被视为显微镜下可观察到的样品面积的一个度量。一般来说,放大倍数随数值孔径的增大而增大,随工作距离的增大而减小。


物镜的色差校正范围从单个焦平面的红、绿校正(消色差)到紫、蓝、绿、红全校正(复消色差),还有中等色差校正(半复消色差)。在最低校正水平,消色差物镜,甚至对于一些高度校正的复消色差物镜,蓝光和紫外光的轴向焦点位置不同于绿光和红光,即使在横向(X-Y)场中不同颜色物体的共轴也是如此。当确定两个荧光探针的相对位置或强度时,或在进行对比成像实验时,这种现象会导致严重的问题。除了色差校正外,还可以对物镜中的球面像差进行校正,以获得平坦的视野(称为平场校正)。几乎所有的现代物镜都校正以消除轴外像差,如慧差和散光。

各大显微镜制造商提供各种各样的物镜,其数值孔径、放大率和工作距离几乎相同。一般来说,这些物镜设计包含了光传输效率与更好的光学校正间的权衡以及保持光偏振性上的表现。校正色差和球面像差所需的额外玻璃透镜元件往往会降低光传输效率(其实就是降低亮度)。相比之下,设计用于荧光显微镜的物镜在更宽的光谱范围内发射更多的光,但通常对球差和色差的校正较差。物镜的绝对透光效率往往是制造商的秘密。为透射光(DIC、HMC和PH)设计的物镜可以高度校正,但对光传输效率较低。相差物镜在后焦平面附近有一个相位环,对传输效率只有轻微的影响(降低5%到15%)。一般来说,荧光物镜是活体细胞成像的最佳选择,除非实验需要高分辨率的DIC或偏光物镜。


许多物镜的光学设计要求它们与具有特定厚度(通常为0.17毫米)的盖玻片精确匹配,该值通常刻在物镜筒上(见图2)。事实上,所有为生命科学制造的显微镜都默认配备有使用对1.5号(即0.17毫米厚)的盖玻片进行校正的物镜。对于要求较高的实验,对盖玻片有非常严格的规格要求。根据放大倍数的不同,不经意地使用1号或2号盖玻片会显著降低图像质量。相对的,为电生理研究设计的物镜称为水镜,不需要盖片。这些物镜有一个陶瓷或复合聚合物鼻片,在观察活体标本时可以直接浸入培养基或缓冲液中。

油浸物镜设计用于对附着或牢牢压在盖玻片上的薄样品进行成像。如果样品和盖片之间存在液体介质,或者对超过20微米厚细胞进行成像,则浸油物镜的聚焦特性开始下降,在最坏的情况下,会给图像添加噪声(聚焦不当的光)。当对厚组织切片和植物标本进行成像时,这点会十分明显。由于亲水性浸泡介质的折射率与培养基和胞质溶胶的折射率更为接近,因此在这种条件下开发了水和甘油浸入物镜。尽管水和甘油浸入物镜的数值孔径(1.2~1.3)低于油浸入物镜(高达1.45),但在活体细胞成像条件下,图像的信噪比和分辨率可能会显著提高。对于这些物镜,平场校正通常很差,但典型的激光扫描共聚焦显微镜或像相机捕获的图片视场小于中心三分之二,这是一个大多数物镜都具有平场的区域,与校正系数无关。


以下划重点

总之,在选择用于活细胞成像的物镜时,应考虑几个关键的指导原则。在所有情况下,研究者都应选择有足够工作距离对样品感兴趣区域进行聚焦的数值孔径最大的物镜。如果样品与盖玻片直接接触,浸油物镜通常是提供光收集效率的最佳选择。锘海代理的Etaluma活细胞工作站LS720提供了从2.5x到100x各个倍率物镜的选择。有最基础的平场消色差物镜,也有高端的长工作距离相差物镜,复消色差物镜可供选择。支持RMS螺纹,45mm齐焦距离的各型物镜。

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