CCK-8检测细胞增殖/毒性的原理、方法及注意事项

来源: 北京安必奇生物科技有限公司   2019-11-3   访问量:436评论(0)

Cell Counting Kit-8(简称CCK-8)是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的快速高灵敏度检测试剂。WST-8,是一种类似于MTT的化合物,它在电子载体(1-Methoxy PMS)存在的情况下,被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物(formazan)。细胞增殖越多越快,颜色越深;细胞毒性越大,则颜色越浅,对于同样的细胞,颜色的深浅与活细胞的数量成正比,因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

 CCK-8检测原理图

图1. CCK-8检测原理图

CCK-8的优点

  • 产生的甲瓒产物是水溶性的,无需换液,非常适合悬浮细胞

  • 不需要放射性同位素和有机溶剂,对细胞的毒性小

  • CCK-8细胞活性检测试剂毋需预制,即开即用

  • 灵敏度高,线性范围宽,数据可靠,重现性好

  • 操作简便,省时省力

  • 适合于高通量药物筛选

CCK-8的缺点:

  • 与MTT法相比,CCK-8的价格比较贵

  • CCK-8试剂的颜色为淡红色,与含酚红的培养基颜色接近,操作过程中容易漏加或多加

实验一:细胞增殖分析

1)制备细胞悬液,计数。
2)在96孔板中接种细胞悬液,每孔约100μl,同样的样本可做3个重复。
3)将培养板放入培养箱中预培养一段时间(37℃, 5%CO2),细胞贴壁需要大约2-4h,如果是悬浮细胞,该步骤可以省去。
4)每孔各加入10μl CCK-8溶液,由于加入的CCK-8量比较少,可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀,或者直接配置含10%CCK-8的培养基,以换液的形式加入。另外注意,加样的过程中尽量不要产生气泡。
5)将培养板放入培养箱中孵育1-4h。因为细胞种类不同,形成的formazan的量也不一样,所以如果显色不够的话,可以延长培养时间,特别是血液细胞形成的formazan很少,需要较长的显色时间(5-6h)。
6)酶标仪测定450nm处的吸光值(OD)。
7)若暂时不测定OD值,可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,室温下避光保存,这样可以保证OD值在24h内不发生变化。

实验二:细胞毒性分析

1)制备细胞悬液,计数。
2)在96孔板中接种细胞悬液,每孔约100μl,同样的样本可做3个重复。
3)将培养板放入培养箱中预培养一段时间(37℃, 5%CO2),细胞贴壁需要大约2-4h,如果是悬浮细胞,该步骤可以省去。
4)向培养板各孔中加入不同浓度的毒性物质(药物、化学试剂等待检测物质)。
5)将培养板放入培养箱中孵育一段时间,例如6、12、24、48h,具体时间要看待测物质的性质和细胞的敏感性。
如果待检测物质有氧化性或还原性,可在加入CCK-8之前更换新鲜培养基,以去掉待测物质的影响。如果影响比较小或者没有影响,可以不更换培养基,直接扣除培养基中加入药物后的空白吸收即可。
6)向每孔中加入10μl CCK-8溶液,由于加入的CCK-8量比较少,可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差,建议在加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀,或者直接配置含10%CCK-8的培养基,以换液的形式加入。另外注意,加样的过程中尽量不要产生气泡,以免影响OD值读数。
7)将培养板放入培养箱中孵育1-4h。因为细胞种类不同,形成的formazan的量也不一样,所以如果显色不够的话,可以延长培养时间,特别是血液细胞形成的formazan很少,需要较长的显色时间(5-6h)。
8)用酶标仪测定450nm处的吸光度(OD)。
9)若暂时不测定OD值,可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液,室温避光保存,这样可以保证OD值24h内不发生变化。

活力计算:

细胞活力(%)=[A(加药)-A(空白)]/[A(0加药)-A(空白)] ×100
A(加药):具有细胞、CCK-8溶液和药物溶液的孔的OD值
A(0加药):具有细胞、CCK-8溶液而没有药物溶液的孔的OD值
A(空白):没有细胞的孔的OD值
细胞活力:细胞增殖活力或细胞毒性活力

注意事项:

  • 接种细胞数:针对标准96孔板,贴壁细胞的最小接种量为1000个/孔 (100μl培养基)。若为白细胞,接种量不低于2500个/孔 (100μl培养基)。如若使用24孔板或6孔板,应预先计算每孔相应的接种量,并按照每孔培养基总体积的10%加入CCK-8溶液。

  • CCK-8 反应时间:悬浮细胞与贴壁细胞相比较难显色,因此需要增加细胞数量并延长CCK-8反应时间。另外,在培养箱中孵育期间,培养板最外一圈的孔最容易干燥挥发,造成体积不准确,从而增加误差,因此,建议最外一圈的孔只加培养基,不作为测定孔用。另外,如果细胞培养时间较长导致培养基颜色发生了变化,应洗涤细胞更换培养基后再加CCK-8进行检测。

  • 空白对照:在不含细胞的培养基中加入CCK-8,测定450nm的吸光度即为空白对照。在细胞毒性实验中,还应考虑药物的吸收,可在加入药物的培养基中加入CCK-8,测定450nm的吸光度作为空白对照。

  • 测定波长:如果样品为高浑浊度的细胞悬液,建议采用双波长进行测定,检测波长450-490nm,参比波长600-650nm。



北京安必奇生物科技有限公司   商家主页

地址:中国北京市通州区科创东七街9号三楼
联系人:章文羿
电话:400-008-6094
传真:
Email:info@abace-biology.com