细胞形态异常,鱼骨图来帮忙(二)

来源: 上海逍鹏生物科技有限公司   2019-11-15   访问量:685评论(0)

 

上次的鱼骨图分析大家还没有看过瘾吧

这不,小编又双叒叕来啦!


说完外源污染,那么接下来我们再从细胞层面讨论讨论

———内源异常



内源异常同样也可以分为以下几点

 人为选择/突变

 老化

 细胞冻存/复苏

 融合度过高才传代(>90%)

 传代密度过低


接下来,我们将逐条为您剖析噢~


人为选择/突变



在体外培养细胞的过程中,细胞会因操作过程而产生人为筛选:


  1. 胰酶消化是最常被忽略的人为选择过程,易被消化的细胞容易被传代;


  2. 细胞过度的分化或刺激时及可能造成细胞异常的突变,例如 HeLa cell虽然还保有人的基因序列,但染色体数目曾被观察到有异常突变增加(原HeLa为46条,目前有研究人员观察到70-90条染色体的案例);


  3. 文献报导指出,hES 细胞株已被证实原位癌基因(TP53) 变异概率,随着培养代数增加更易有突变产生 (Nature 2017)。


解决方案:


建立并记录好细胞档案(形态、生长繁殖曲线、染色体核型情况、代谢特性、分化特性、有无支原体和潜存病毒等),为保障实验材料的一致性,应将长期使用的细胞株建立细胞种子库(Seed Stock)与工作库(Working Stock);细胞株建库资料要详细记载,并定期每3-6个月安排身份鉴定 (STR)。


美国细胞库(ATCC建议细胞株入库的基本要求:


(1)培养简历 :组织来源日期、物种、组织来源、供体正常或异常健康状态、性别、年龄、细胞已传代数等;
(2)冻存液 、培养基和保护剂名称;
(3)细胞活力 ,冻融前后细胞接种存活率和生长特性(细胞倍增时间,生长繁殖曲线,分裂指数等);
(4)培养基种类和名称、血清种类及浓度;
(5)细胞形态类型,如内皮、上皮或成纤维细胞等;
(6)核型二倍体或多倍体,标记染色体有或无;
(7)无污染情况包括细胞、真菌、支原体、原虫和病毒等;
(8)物种检测,以证明细胞有无交叉污染;
(9)免疫检测一两种血清学检测;
(10)细胞建立者姓名、检测者姓名。    
 


老化


无论是原代细胞或是细胞株,在细胞培养过程中细胞老化现象是存在且常见的,但却容易被操作人员忽略,老化的细胞会出现特征包括:细胞增殖变慢、细胞核体积异常及多核(4-8核)、表面分泌物增多、细胞体积增大、细胞扁平、细胞质中出现空泡等现象。


老化细胞不会立即死亡,但其基因表达会发生变化,如果细胞老化现象严重,建议从种子库或工作库重新复苏细胞。


解决方案:

 

Dr. Cell可提供:细胞老化检测(Cell Senescence Detection)
细胞老化检测可准确地判断出老化细胞的百分比,以决定是否要使用代数更低的细胞,维持实验材料的一致性。细胞培养过程,防止衰老不二法门:还是要做到勤观察、勤换液、勤传代、勤保种。一旦细胞衰老后,细胞很难再重新年轻化,此时,只能重新复苏细胞。

 

   

图1.衰老细胞                           图2.正常细胞



细胞冻存/复苏


慢冻快融

冻存细胞过程,建议程序降温速度为1℃/min。细胞冻存时,细胞内外的水分会很快形成冰晶,冰晶的形成后会造成细胞损伤或细胞的死亡。为了保护细胞,冻存时会添加保护剂在冻存液中,目前多采用DMSO或甘油,使冰点下降,提高细胞膜对水的通透性。


复苏细胞过程,让细胞冻管在37℃环境快速解冻,待其全部快速融化,避免冰晶对细胞造成伤害;解冻后的细胞可直接接种到含完全培养基的细胞培养瓶中进行培养,24小时后再更换新鲜完全培养液,以去除旧培养液中的DMSO; 如果担心DMSO造成细胞毒性,可以待细胞解冻后将细胞缓慢加至含培养基离心管中离心,以稀释DMSO的浓度。复苏的细胞,约需数日或传一至二代,其表现才会恢复稳定。


解决方案:
掌握“慢冻快融”的原则,进行程序降温
慢冻→两种办法:

1.手动程序降温,将细胞依序放在4℃(30分钟)、-20℃(1小时)、-80℃(过夜)后移至液氮中保存。

2.程序降温盒,一般最广泛使用的降温法,为一种特制冷冻容器(填充异丙醇或依靠特制金属导热),使细胞以每分钟约-1℃的速度降至-80℃(过夜),然后移至液氮中保存。


快融:将冻存在液氮中的细胞冻存管快速移至已37℃预热的水浴锅中(水面需低于管口,避免水分意外进入冻存管造成潜在污染),使细胞冷冻悬液迅速融化;此做法能让细胞冷冻悬液快速通过-20℃~0℃这个结晶形成温度范围,避免冰晶进入细胞形成再结晶,对细胞造成二次伤害。


Biological Industries(BI)可提供:

 

融合度过高才传代(>90%)

一旦细胞养太久至融合度过高(>90%)才传代,容易使细胞产生老化现象,甚至是堆叠,再消化细胞时不易吹打成单颗细胞,即便再重新铺盘传代,细胞也无法回到原本的特性了。(如:单层细胞,没长满就发生堆叠现象)。

图3


解决方案:


尽量避免融合度过高,镜下观察融合度约达到80%即可传代分盘。
细胞融合度:在细胞培养中指的是细胞在培养表面(培养皿/瓶)所占的比例。



传代密度过低

哺乳动物贴壁培养细胞,若细胞培养到80-90%密度需要开始传代,在传代接种细胞密度过低,细胞间距离太远,就无法在细胞间产生黏附及通信作用,帮助信号传导并活化细胞;总体细胞量不足,分泌的生长因子浓度会不足以产生利于生长的微环境,以上皆会造成增殖速度迟缓或细胞死亡。

 

图4


解决方案:


细胞传代时,要进行准确的细胞计数,确保铺盘的密度。

如何确定细胞的正确初始接种密度? 美国细胞库(ATCC)建议各类不同细胞株接种密度



https://www.atcc.org/support/faqs/8e032/Seeding%20Density%20for%20Cell%20Lines-25.aspx



END

好啦,本期介绍到这里也就啦

后续小编会根据顺序

继续为大家分享噢~


那么即将开学的您有准备好收心吗

小编温馨提示:

 

 

计划千万条,收心第一条。
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