胆囊癌不再可怕!《Molecular Cancer》报道胆囊癌细胞耐药机制

来源: 上海吉凯基因化学技术有限公司   2020-1-13   访问量:221评论(0)

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很多癌症都是前期症状不明显,到后期就已经不能及时根治了。胆囊癌更是其中的“佼佼者”,作为世界第五大常见消化道恶性肿瘤,其症状不明确、不显著,使得多数胆囊癌患者不能及时发现病情从而延误治疗时机,此时手术切除根治术的效果不甚乐观,药物治疗对于此类胆囊癌病人的生存来说尤为重要。


然而胆囊癌细胞对化疗药物极易具有耐药性,故而弄清楚胆囊癌细胞耐药性的具体分子机制成为了胆囊癌治疗研究的重要目标。


2019年4月5号上海交通大学医学院附属新华医院在《Molecular Cancer》(IF:10.679)上在线发表了题为“Long non-coding RNA GBCDRlnc1 induces chemoresistance of gallbladder cancer cells by activating autophagy”的文章揭示了胆囊癌细胞耐药机制:长链非编码RNA-GBCDRlnc1通过激活细胞自噬诱发胆囊癌细胞的化学耐药性。



该研究中作者在进行了微阵列分析、比较了lncRNA在Dox抗性的胆囊癌细胞及其亲代细胞中的表达谱后发现了lncRNA ENST00000425894(GBCDRlnc1)可能与细胞耐药性有关。


在体外和细胞水平上,作者通过敲除或过表达GBCDRlnc1,验证了GBCDRlnc1调节胆囊癌细胞对Dox的敏感性。并发现GBCDRlnc1与PGK1相互作用,抑制其泛素化,从而导致自噬诱发剂ATG5-ATG12共轭物的表达上调,促进细胞自噬进而增强细胞耐药性。这一发现揭示了GBCDRlnc1可能是晚期胆囊癌的潜在治疗靶点。


作者构建了DOX抗性的胆囊癌细胞系NOZ / Dox和GBC-SD / Dox,通过WB及LC3双荧光法发现耐药细胞自噬水平显著升高(图1. A-C),且抑制自噬后细胞中Dox的IC50值显著降低(图1. D),这提示细胞耐药性与其自噬水平的升高有关。


图1. Dox耐性的胆囊癌细胞的耐药性与其增强的自噬活性有关


接着作者通过组学分析方法发现只有lncRNA GBCDRlnc1在Dox抗性的胆囊癌细胞中异常表达,这提示其可能与胆囊癌细胞的Dox抗性有关


图2. LNCRNA在NOZ / Dox细胞中的表达谱


通过对病人和正常人组织检测发现肿瘤患者体内GBCDRlnc1水平显著升高且水平越高其术后存活时间越短,在细胞系中更是发现耐药组GBCDRlnc1水平显著升高(图3. A-C)。


此外通过干扰或过表达GBCDRlnc1发现细胞内GBCDRlnc1水平越高其耐药性越强(图3. D-G)。这表明GBCDRlnc1调节胆囊癌细胞的耐药性


图3. GBCDRlnc1在胆囊癌组织中上调表达


接着作者检测了干扰或过表达GBCDRlnc1后耐药性细胞的自噬水平,结果发现在耐药细胞中GBCDRlnc1能够促进细胞自噬


图4. GBCDRlnc1促进胆囊癌细胞的自噬


接下来,作者通过RNA pull-down分析、WB实验发现GBCDRlnc1可以直接与PGK1相互作用(图5. A-C),且在胆囊癌细胞中GBCDRlnc1抑制PGK1的表达及其泛素化(图5. E-H)。


图5. GBCDRlnc1通过抑制胆囊癌细胞中PGK1泛素化而上调其蛋白表达水平


然后作者设计SiRNA敲减细胞内PGK1表达水平(图6. A),发现敲减PGK1后NOZ / Dox和GBC-SD / Dox细胞对Dox的抗性显著降低(图6. B)、自噬水平显著下降(图6. C、D、E)。


而过表达PGK1后则能逆转GBCDRlnc1下调对化学耐药性和自噬的抑制作用(图6. F)。这表明GBCDRlnc1通过PGK1正向介导胆囊癌细胞的耐药性和自噬活性。


图6. PGK1下调表达能够抑制胆囊癌细胞自噬相关化学抗性


最后作者在在体水平研究,利用作者分别将经GBCDRlnc1干扰慢病毒或对照病毒感染的Dox抗性肿瘤细胞注射到裸鼠中并给予Dox处理,发现GBCDRlnc1干扰组肿瘤大小明显小于对照组(图7. A、B),且自噬水平及自噬诱发剂水平均显著降低。表明GBCDRlnc1可以通过调节自噬水平进而调节胆囊癌细胞的抗药性。


图7. 在体内,GBCDRlnc1下调抑制自噬并提高胆囊癌细胞对Dox的敏感性




总 结




1. GBCDRlnc1其在胆囊癌细胞中高表达与组织学分级和晚期TNM分期有关,有望成为胆囊癌的预后指标;

2. 胆囊癌细胞耐药机制:GBCDRlnc1与PGK1相互作用并阻止PGK1泛素化,导致ATG5-ATG12偶联物表达上调,进而增强细胞自噬,最终导致细胞耐药。



吉凯助力


该研究中所用GBCDRlnc1干扰慢病毒(Lv-GBCDRlnc1-shRNA)和对照慢病毒,以及用于检测细胞自噬水平的LC3双荧光慢病毒(Lv-stubRFP-sensGFP-LC3)均由吉凯基因提供。有效的敲低了肿瘤细胞中GBCDRlnc1的表达水平(图8),并实时监测了肿瘤细胞的自噬水平(图9)。

图8. 肿瘤细胞系中GBCDRlnc1下调效果检测


图9. 建立表达stubRFP-sensGFP-LC3的胆囊癌细胞,实时监测自噬流


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