文献分享|基于转座酶的RNA-seq快速建库流程,助力COVID-19检测新思路

来源: 上海翊圣生物科技有限公司   2020-2-21   访问量:589评论(0)

文献分享|基于转座酶的RNA-seq快速建库流程助力COVID-19检测新思路

文献精读

文献题目RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids

中文题目:直接作用于切割RNA/DNA杂合链的RNA测序方法

发表时间2020.1.27

发表期刊PNAS

影响因子9.58

合作单位:北京大学、清华大学

关键词RNA-SeqTn5转座酶、SHERRYScRNASMART-Seq

背景简介

RNA测序RNA-seq)在基因表达差异分析方面的应用来说颇为成熟,主要包括目标RNA富集及片段化、一链和二链cDNA合成、PCR扩增等几个主要流程。其中二链cDNA的合成是获得高质量文库的关键,但二链cDNA的合成需要引入额外的DNA聚合酶,可能导致测序的偏好性增加

近日,北京大学的黄岩谊和谢晓亮研究团队联合清华大学王建斌研究团队在美国《国家科学院院刊》(PNAS)发表了一篇名为“RNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids”,介绍了一种新的基于Tn5转座酶的转录组测序快速建库方法,不仅可以消除常规RNA-seq需要cDNA二链合成的繁琐性而且极大的突破了Tn5仅在DNA上作用的限制,大大拓展了Tn5转座酶的应用范围,同时或将为牵动人心的新型冠状病毒肺炎(COVID-19)检测提供新思路

文章方法及主要内容

1.样本处理:

1Tn5转座酶和Tn5 D188E突变株的制备、纯化

2HEK293THeLa细胞培养、总RNA提取和纯化mRNA

3单细胞制备

2.研究内容:

1Tn5转座酶通过作用于RNA/cDNA杂合链用于RNA-seq

Tn5RNase HMMLV逆转录酶结构比对和分子对接的结果表明Tn5能够作用于RNA/DNA杂交双链。随后将Tn5应用在HEK293T提取的mRNA/cDNA杂合链上,并进一步PCR扩增,片段化的RNA/cDNA杂合链和扩增产物的大小分布显示,扩增后的产物分布比片段化的产物长100-150 bp左右。因此Tn5可作用于RNA/DNA杂合双链同时应用于RNA-Seq快速建库方法。

1.Tn5转座酶在RNA/DNA杂合链的作用

2SHERRY应用于一步快速RNA-seq文库制备

Tn5转座酶作用于RNA/DNA杂合链的转录组测序快速建库方法作者起名为SHERRYSequencing HEteRo RNA-DNA-HybridSHERRY法转录组快速建库流程:不同种类的RNA经过oligo-dT引物的反转录后,Tn5转座酶随机结合在RNA/DNA杂合链上进行切割;在Tagmentation之后,转座酶会在杂合链两端加上adaptor接头,随后进行延伸反应得到完整的含接头的双链DNA,最后在测序引物作用下进行之后的PCR文库扩增。

2.SHERRY转录组测序技术路线

SHERRY法转录组快速建库流程和常规RNA-seq法在10 ng200 ng的起始RNA上进一步验证,结果显示起始量为10 ngRNASHERRY法检测结果更精确差异表达基因检测能力方面,SHERRY常规RNA-seq检测差异基因数目和fold changes数较为一致。同时实验发现scSHERRY法在单细胞转录组测序中表现为更高的测序质量和更低的偏好性。

3.SHERRY法在转录组测序的应用

文章亮点

亮点1Tn5转座酶识别RNA/DNA杂交双链并一步完成片段化和加接头反应,突破了在双链DNA上应用的限制;

亮点2:基于SHERRYRNA-seq整体包含三个流程:RNA逆转录、RNA/cDNA的片段化和PCR扩增,简化了常规RNA-Seq建库流程,总体耗时仅约4小时,手动操作时间少于30分钟,同时可在一个管子中完成反应。实现RNA的快速建库,也极大的保证了测序的真实性。

亮点3:测序成本方面,SHERRY法转录组建库仅为常规RNA-seq法的五分之一,大大节省实验成本。

总结

基于Tn5转座酶直接作用于RNA/DNA杂合链的片段化原理开发了一种转录组测序快速建库新方法-SHERRY,进一步拓展了Tn5转座酶的新用途,不仅解决了常规RNA-seq过程繁琐、耗时长和偏好性大的问题,同时成本方面也大大降低。因此,相较于传统的RNA文库制备方法,SHERRY快速建库有着更大的竞争力。当前常规RNA-seqSARS-CoV-2的鉴定、分型、溯源、诊断等方面展现了重要作用,但仍基于传统的病原微生物宏基因组测序方法,耗时长且过程繁琐。而基于Tn5转座酶的转录组测序快速建库方法或将为COVID-19快速、精准检测带来新的曙光。

参考文献:Lin Di, Yusi Fu, Yue Sun, Jie Li, Lu Liu, Jiacheng Yao, Guanbo Wang, Yalei Wu, Kaiqin Lao, Raymond W. Lee, Genhua Zheng, Jun Xu, View ORCID ProfileJuntaek Oh, View ORCID ProfileDong Wang, X. Sunney Xie, Yanyi Huang, and View ORCID ProfileJianbin WangRNA sequencing by direct tagmentation of RNA/DNA hybrids2020. PNAS,117(6):2886-2893.

原文链接:https://www.pnas.org/content/pnas/117/6/2886.

翊圣生物长期对高通量测序技术保持高度关注,此次新冠病毒的来临,我们推出种高效病毒基因测序方案,每日最多可检测万人份新型冠状病毒样本,助力一线疫情防控。

方案一产品:

试剂类别

产品名称

规格

货号

核糖体去除

Hieff NGS® MaxUp rRNA Depletion Kit (Human/Mouse/Rat)

8/24/96 T

12253ES08/24/96

Hieff NGS® RNA Cleaner

5/60/450 mL

12602ES08/56/75

华大平台

RNA建库

Hieff NGS® Dual-Mode RNA Library Prep Kit for MGI®

8/16/96 T

13332ES08/16/96

Illumina平台

RNA建库

Hieff NGS® Dual-Mode RNA Library Prep Kit for illumina®

8/16/96 T

12251ES08/16/96

方案二产品:

试剂类别

产品名称

规格

货号

逆转录酶

Hifair® IV Reverse Transcriptase 第四代耐热逆转录酶

10000/5*10000 U

11112ES92/93

Tn5建库试剂盒

Hieff NGS® Fast Tagment DNA Library Prep Kit for Illumina® (for 1 ng)

8/24/96 T

12206ES08/24/96

Tn5接头

Hieff NGS® Tagment Index Kit for Illumina® (96 Index)

96 T

12610ES96

往期精彩推荐:

1.解析|高通量测序技术是如何应用于新冠病毒研究的

2.翊圣生物|助力新冠肺炎诊断和疫苗开发

3.新型冠状病毒来者不善,翊圣生物提供试剂盒所需的核心分子酶制剂



上海翊圣生物科技有限公司   商家主页

地址:上海市浦东新区天雄路166弄一号楼三层南单元
联系人:钟珍
电话:400-6111-883、021-34615995
传真:021-34615995-188
Email:zhongz@yeasen.com