为什么我们需要全长CD20,看Genentech对CD20的结构解析

来源: 北京百普赛斯生物科技有限公司   2020-2-25   访问量:427评论(0)

 

2020年2月20日,Science在线发表了Genentech CD20-利妥昔单抗复合物冷冻电镜结构的文章:"Structure of CD20 in complex with the therapeutic monoclonal antibody rituximab"<文尾可下载文献全文>.

 

文章突破性的解析了全长CD20以及CD20与RTX Fabs复合物的三维结构,同时首次揭示了RTX对CD20的识别表位以及全长CD20在相关研究中的重要意义。此前认为RTX对CD20的识别表位位于ECL2,该研究发现RTX对CD20的识别不止有一级表位ECL2(170ANPSE174),还包括二级表位ECL1-ECL2。通过SPR实验比较RTX与全长CD20以及与CD20 ECL2多肽表位的亲和力差别,进一步揭示了ECL1-ECL2二级表位对RTX与全长CD20达到nM级亲和力所起到的关键性作用。

Fig. 3. Key molecular interactions between CD20 and RTX. Ribbon diagrams of the CD20:RTX Fab structure, with key amino acid side chains involved in CD20:RTX or RTX:RTX shown in stick representation. (A) Top view of the center of the complex, where HC.Tyr97 mediates Fab:Fab and Fab:CD20′ contacts. (B) The canonical RTX epitope 170ANPSE174, in addition to being recognized by RTX’s heavy chain (left, purple), is also involved in a hydrogen bond network with Tyr97′ from the distal RTX Fab (right, grey). (C) Additional Fab:Fab contacts between heavy chain (HC) loops H3 and H1 and light chain (LC) loop L2. (D) A secondary epitope consisting of ECL1 and ECL2 is contacted by RTX’s LC loop

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更重要的是,该研究发现将RTX中识别ECL1-ECL2二级表位的关键位点(LC.Ser28)突变后,不同程度的减弱了RTX-CD20 affinity(~20倍)、RTX-cell binding(~25%)和RTX的CDC activity(IC50 > 10x higher),而将RTX中识别ECL1-ECL2二级表位的另一关键位点(LC.Ser31)进行突变,则更大程度的减弱了RTX-CD20 affinity(~100倍)、RTX-cell binding(~50%),且导致RTX的CDC activity几乎完全淬灭。可以说,无论是RTX对CD20独特的binding模式,还是RTX的高CDC activity,均离不开ECL1-ECL2二级表位,也表明了相比于ECL2,全长DC20在相关研究中的重要意义。

Fig. 4. Multiple CD20:RTX and RTX:RTX interactions enable cell binding and CDC. (A) Surface representation of the CD20:RTX Fab complex. The surfaces buried by complex formation are colored in yellow (CD20:RTX), orange (CD20′:RTX′), or red (RTX:RTX′). (B) Open-book representation of the same surfaces, with surface area measurements for each buried surface indicated. Residues mutated as part of this study are labeled in the top left panel and are not involved in the primary paratope. The primary epitope (dashed line) only accounts for less than half (440 Å2 out of 1,015 Å2) of the total Fab binding area. (C) Surface representation of the CDR face of RTX Fab, with the ECL2 turret epitope shown (green), as well as the positions of the point mutations under study. (D and E) Complement-dependent cytotoxicity (D) and cell binding (E) of RTX mutants are plotted as a function of antibody concentration, and compared to wild-type RTX and OBZ.

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为了解决这些问题,ACROBiosystems采用独特的设计开发了全球独有的由HEK293表达的多次跨膜全长CD20蛋白,包括未进行标记的和生物素标记的Nanodisc或DDM不同版本产品。全长CD20蛋白同时有small loop和big loop,具有完整的天然正确构象,可用于免疫/ ELISA/ SPR/ BLI/ FACS。我们验证了Rituximab、Ofatumumab与全长CD20蛋白的结合活性,全长CD20蛋白展现出纳摩尔级别的高亲和力,可免费提供Protocol。

 

不同类型的全长CD20蛋白


>>>>DDM版本


DDM是一种非离子型去垢剂,能够使脂膜解体释放膜蛋白,并在溶液中为去膜状态下的膜蛋白提供疏水环境,维持和保护膜蛋白的疏水跨膜结构。但DDM的存在会破坏细胞膜的结构,一般不用推荐于细胞实验。

 

>>>>Nanodisc版本(不含去垢剂)


Nanodisc (纳米磷脂盘)是由膜支架蛋白(membrane scaffold proteins, MSPs)和磷脂分子构成的磷脂双分子层类膜结构,膜蛋白可以整合到Nanodisc的特殊结构中,保持其生物学活性并有很好的水溶性,应用更广泛。ACROBiosystems使用的Nanodisc技术已经获得专利持有方的授权,生物药研发企业在研发过程中可放心使用。

Ilia G. Denisov, et al., Nanodisc in membrane biochemistry and biophysics. Chem Rev. 2017

 

全长CD20蛋白能提供更好的活性


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ACRO提供的全长CD20蛋白活性经ELISA/ SPR/ BLI验证,可免费提供相应的Protocol


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Loaded MabThera® (Rituximab) on ProteinA Biosensor, can bind Human CD20 Full Length, His Tag, HEK293 (SPR verified) (Cat. No. CD0-H52H3) with an affinity constant of 8.1 nM as determined in BLI assay (ForteBio Octet Red96e).

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产品列表


ACRO开发的生物素标记的全长CD20蛋白(DDM和Nanodisc)经FACS验证具有高生物活性。

Cat. No. Type Product Description
CD0-H52H3 Unconjugated Human Full Length CD20 Protein, His Tag (DDM)
CD0-H82E5 Biotinylated

Biotinylated Human Full Length CD20 Protein, His,Avitag™ (DDM)

CD0-H82E3

Biotinylated Biotinylated Biotinylated Human Full Length CD20 Protein, His,Avitag™ (Nanodisc)

 

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