核内circRNA的机制研究如何开展?

来源: 上海吉凯基因化学技术有限公司   2021-2-5   访问量:1386评论(0)

circRNA作为单链闭合的环状RNA分子,近年来研究热潮居高不下。除了阐述ceRNA机制和翻译多肽潜能的质circRNA外,关于核内circRNA的机制研究也很多,这些核内circRNA大多数是通过与蛋白修饰酶、转录复合物或者与亲本基因座等结合影响基因的转录过程。那么具体的调控机制如何开展呢?


一、蛋白修饰


核内circRNA与甲基化酶、组蛋白转移酶等作用可以影响基因调控区的蛋白修饰,从而激活或抑制基因的转录。Molecular Cancer杂志发表过1篇核内circRNA通过使基因启动子区发生组蛋白乙酰化激活基因转录的研究1。研究者起初筛选到1个胃癌组织中低表达的环状RNA circMRPS35(2-5外显子环化),其表达与肿瘤体积等呈负相关。FISH检测circMRPS35位于核内。


GO/KEGG通路分析发现circMRPS35和FOXO信号通路显著相关。通过荧光素酶实验得知:circMRPS35能够上调FOXO1/3a启动子活性。

进一步通过pull-down、RIP实验得知:circMRPS35可以结合组蛋白乙酰转移酶KAT7。由于KAT7能够影响H4K5组蛋白乙酰化2-3,猜想circMRPS35对FOXO1/3a的调控是否与启动子区乙酰化修饰相关?通过pull-down、ChIP和ChIRP实验得知:circMRPS35可以结合H4K5AC,并和KAT7作用于FOXO1/3a启动子区。FISH实验表明三者存在胞内共定位。



在该文中,核内circMRPS35通过充当一个支架,招募组蛋白乙酰化转移酶KAT7,诱导FOXO1/3a启动子区H4K5组蛋白乙酰化,进而促进FOXO1/3a的转录。


二、转录复合物招募


除了影响蛋白修饰过程外,核内circRNA也可以招募转录相关蛋白或某些聚合酶形成转录复合物等,调控基因的转录4。在之前发表的一篇文章中,作者筛选出两个与RNA Pol II结合的核内环状RNA circEIF3J/PAIP2。它们与亲本基因共定位于核内,干扰circRNA后EIF3J和PAIP2 mRNA的表达显著下降。


于是猜想circEIF3J/PAIP2与亲本基因转录有关。通过pull down、ChIRP和ChIP等检测得知:circEIF3J/PAIP2、U1 snRNP和Pol II结合在EIF3J/PAIP2基因的转录调控区。


该文中,核内的circEIF3J/PAIP2通过与U1 snRNA作用,招募U1 snRNP、Pol II等形成转录复合物,结合至亲本基因启动子处,进而促进基因的转录。


三、抑制转录


当然,核内circRNA除了与蛋白作用之外,还能结合在亲本基因座上,在空间上阻碍转录酶向下游继续延伸,进而抑制基因的转录5。Molecular Cancer杂志发表过1篇文章,研究者发现circSMARCA5(15-16外显子环化)在癌组织中低表达,其与SMARCA5 mRNA在乳腺癌血液中的表达水平呈负相关。


FISH检测到circSMARCA5位于核内,而SMARCA5位于细胞质中。qPCR得知过表达circSMARCA5能够下调15-24号外显子的表达,但对1-14号外显子表达无影响。那么核内circSMARCA5如何影响亲本基因mRNA表达呢?


通过3’RACE扩增到1个15-24外显子缺失的转录本。通过CHIP和荧光素酶实验得知:1-14外显子结合的pol II酶多于15-24外显子,过表达circSMARCA5能够抑制外显子15的转录。


通过DNA-RNA杂交抗体S9.6进行Dot-blot检测得知:circSMARCA5能够结合15外显子5’端形成R环。


该R环阻碍15号外显子的转录延伸,下调亲本基因SMARCA5的表达,抑制DNA的损伤修复过程。


核内circRNA的研究机制比较多样化。对比这几篇文章不难发现,前期找对靶基因或作用蛋白非常重要,通过pull-down、ChIRP等实验获取互作分子,再通过RNA-seq或者质谱鉴定出关联分子,最后研究出其内在的分子机制!


吉凯基因提供核circRNA的过表达、敲低、荧光素酶、RNA-seq及质谱等服务,满足研究核circRNA的大部分实验需求。所以,不想止步于ceRNA机制的老师们,着手于核内circRNA转录调控机制的研究也是个不错的选择。


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